产碱假单胞菌脂肪酶的克隆表达及酶学性质研究

【目的】克隆产碱假单胞菌的脂肪酶基因,实现其在大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究。【方法】通过基因文库构建和PCR,获得脂肪酶基因,并以pET30a(+)为表达载体、E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在大肠杆菌中进行异源表达,表达产物经HisTrapTM亲和层析柱纯化后进行酶学性质研究。【结果】从产碱假单胞菌中克隆得到一个脂肪酶基因,大小为1 575 bp(GenBank登录号为JN674069)。该酶分子量为55 kD,最适底物为p-NPO,最适反应温度和pH分别为35°C、pH 9.0。重组酶经1 mmol/L的Cu2+处理30 min可使酶活提高至156%。在最适反应条件下重组酶的比活力为275 U/mg,Km和Vmax分别为80μmol/L和290 mmol/(min.g protein)。【结论】产碱假单胞菌脂肪酶基因的克隆与表达不仅积累了脂肪酶基因的资源,并为其在手性拆分中的应用奠定基础。     

卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质

【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP~+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca~(2+)、Cu~(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。     

黑曲霉（Aspergillus niger）F044脂肪酶新型基因lipB的克隆、表达及酶学性质分析

摘要：【目的】本研究拟克隆新型的黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶（EC 3.1.1.3）基因,实现其在大肠杆菌（Escherichia coli）的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。【方法】通过PCR和RT-PCR克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框（ORF）克隆入融合表达载体pET28a;表达产物经Ni-agarose纯化后对LipB进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。【结果】成功地从A. niger F044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB,获得了该基因的全基因组序列和cDNA序列（GenBank: FJ536287、FJ536288）,并实现了其在E. coli中的高效表达。LipB分子量约为43.0 kDa,最适底物为pNPC（C8）,酶学动力学常数Km=5.98 mmol/L,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;该酶能在40℃条件下保持稳定,在60℃条件下处理1 h后残余酶活仅为18.8%;该酶对Ca2+敏感,当脂肪酶经2 mmol/L Ca2+处理1 h后,酶活提高了2.6倍。圆二色谱分析表明该酶在Ca2+处理前后具有明显的结构变化。【结论】新型A. niger脂肪酶lipB基因的克隆不仅积累了脂肪酶基因资源,而且为高效基因工程菌的构建及规模化应用奠定基础;对LipB的酶学性质分析表明该酶在食品和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1菌株γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh 的克隆、表达及酶学性质

【目的】γ-丁基甜菜碱羟化酶是生物体内合成L-肉碱的关键酶。从假单胞菌(Pseudomonas sp.)L-1中克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为生物转化生产L-肉碱奠定基础。【方法】通过PCR克隆γ-丁基甜菜碱羟化酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET-15b;表达产物经His.Bind Resin纯化后对BBH进行酶学性质及三维空间结构分析;并以静止细胞进行L-肉碱的转化。【结果】成功地克隆了一个γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh(GenBank:JQ250036),并实现了其在E.coli中的高效表达。融合蛋白以同源二聚体的形式存在,单个亚基的分子量约46.5 kDa,最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5。该酶在45℃以下稳定。在pH6.0时该酶有最高的pH稳定性。以表达bbh基因的重组大肠杆菌静止细胞转化L-肉碱,L-肉碱产量可达12.7mmol/L。【结论】Pseudomonas sp.L-1γ-丁基甜菜碱羟化酶与现有报道的bbh基因有较大的差异。由该基因表达的γ-丁基甜菜碱羟化酶能有效地转化γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱。本研究不仅丰富了γ-丁基甜菜碱羟化酶基因资源,而且为L-肉碱的生物转化提供了一种新的转化方案。     

Proteus sp.脂肪酶基因在大肠杆菌中表达及性质研究

目的:筛选获得高活力的微生物脂肪酶,实现其异源高效表达。方法:通过富集培养、平板筛选、单菌落发酵验证以获得产脂肪酶菌株,克隆脂肪酶基因,构建重组质粒在大肠杆菌中表达,纯化后进行酶学性质研究。结果:获得一株高产脂肪酶的菌株,经16S rDNA鉴定属于Proteus sp。根据已报道的来源于Proteus vulgaris的脂肪酶基因设计引物,克隆其全长基因,大小为864 bp,编码287个氨基酸。构建重组表达质粒pET32a-lipK19,在大肠杆菌中表达酶活达1 500 U/mL。该脂肪酶的最适温度为40℃,最适pH为9,在pH 8~10之间稳定性较好,Ca2+对酶有激活作用,表面活性剂等对酶抑制作用明显,对有机溶剂有一定的耐受性。结论:克隆表达了一Proteus sp脂肪酶,并对其性质进行了研究,为其应用奠定基础。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

南极菌产琼胶酶aga3311的表达、性质及其降解特性

【目的】本文通过对具有琼胶降解能力的南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ21全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶疑似序列aga3311,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行了验证和分析。【方法】首先对aga3311进行克隆和表达;采用Ni-NTA对重组酶进行纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;用薄层层析(TLC)和质谱(MS)技术对Aga3311的酶解产物进行分析。【结果】构建的重组表达质粒p ET-30(a)+aga3311能够在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现高效表达,其中可溶性表达为30%左右;纯化的重组酶Aga3311分子量为87 k Da,其最适作用温度为35°C,30–45°C的范围内稳定性较高,50°C则迅速失活,具有热不稳定的特征;最适p H为7.0,在p H 4.0–10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;金属离子Fe~(3+)、Be~(2+)、Zn~(2+)和Ca~(2+)均能显著提高Aga3311的活性,特别是Ca~(2+)使其酶活提高1倍。该酶的酶解终产物经TLC和质谱分析主要为新琼二糖。【结论】重组酶Aga3311为Glyco_hydro_42家族的外切型β-琼胶酶,能够特异性降解琼脂糖生成新琼二糖。     

来源于海洋细菌Altererythrobacter luteolus SW109T的新型酯酶E29的克隆表达及其酶学性质

【目的】克隆表达一个来源于海洋细菌的酯酶E29,并研究其酶学性质。【方法】从细菌Altererythrobacter luteolus SW109T中筛选并扩增出一个酯酶基因,将其克隆至p SMT3载体上,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,分析表达产物的酶学性质。【结果】氨基酸序列分析结果表明,酯酶E29属于脂类水解酶第二家族(Family II)。酶学性质分析结果显示,酯酶E29的最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,最适反应温度为45°C,最适反应pH为8.5;10 mmol/L的Co~(2+)和Mn~(2+)及15%的异丙醇和乙腈能强烈抑制酯酶E29的活性,1%的SDS能使酶失活,甘油的存在能促进酶活性。【结论】酯酶E29是一个海洋来源的新型酯酶,其具有较高的酶活力值、较宽的底物谱以及对部分有机溶剂和金属离子较好的耐受性,在工业方面具有潜在的应用价值。     

高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp. PKU#SW7诱变株的筛选

【目的】对野生菌株Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变育种,筛选高产DHA突变株。【方法】采用UV诱变和化学药物胁迫筛选方式,以菌株的生物量、油脂产量、DHA产量作为筛选指标,获得高产DHA突变株。【结果】经鉴定获得一株DHA高产突变株PKU#PM003,该菌株传代4次后仍保持较好的遗传稳定性。摇瓶发酵后,PKU#PM003生物量产量高达6.62 g/L,比原始菌株5.95 g/L提高了11.26%,脂肪酸含量高达4.01 g/L,比原始菌株3.18 g/L提高了26.1%,DHA在脂肪酸中所占比例由29.97%增加到33.43%,产量提高了41.01%,油脂突变效果显著。【结论】突变株PKU#PM003可作为性状优良的工业化发酵生产菌种,并在DHA产量提升上仍具有巨大的空间。     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

[背景]D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛.D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力.[目的]克隆一个链霉菌(Streptomyces sp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(sssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备...     

对硝基苯酚降解菌Pseudomonas sp. PDS-7的降解特性及 其降解相关基因的克隆

[目的]本研究的目的是分离对硝基苯酚(PNP)降解菌,研究其对PNP的降解特性;克隆其降解相关基因,并进行表达.[方法]本研究通过富集培养法和系列稀释平板涂布法分离PNP降解菌株;采用形态观察、生理生化特征测定和16S rDNA分析对菌株进行初步鉴定;通过摇瓶试验研究菌株降解特性;利用SEFA-PCR技术克隆降解相关基因,并亚克隆到表达载体pET29a中,构建重组表达质粒pETpnpC,再转入受体菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达;通过分光光度法测定表达产物的酶活力.[结果]分离到一株PNP降解菌PDS-7,将该菌株鉴定为假单胞菌属(Pseudomonassp.);该菌株能够以PNP作为唯一碳源、氮源和能源生长,菌株对PNP的最高耐受浓度为80 mg/L,最适降解温度为30℃,偏碱性条件有利于菌株对PNP的降解;克隆了PNP降解过程中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC及马来酰醋酸还原酶基因pnpD(GenBank登陆号EU233791);将pnpC在E.coli BL21(DE3)菌株进行了诱导表达,表达产物对偏苯三酚和邻苯二酚均有邻位开环活性,比活力分别为0.45 U/mg protein和0.37 U/mg protein,表明偏苯三酚1,2-双加氧酶基因pnpC得到了活性表达.[结论]分离鉴定了一株PNP降解菌Pseudomonas sp.PDS-7,研究了该菌株的降解特性,克隆和表达了降解相关基因.     

Functional expression of a novel alkaline-adapted lipase of Bacillus amyloliquefaciens from stinky tofu brine and development of immobilized enzyme for biodiesel production

Using enrichment procedures, a lipolytic strain was isolated from a stinky tofu brine and was identified as Bacillus amyloliquefaciens (named B. amyloliquefaciens Nsic-8) by morphological, physiological, biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. Meanwhile, the key enzyme gene (named lip _BA) involved in ester metabolism was obtained from Nsic-8 with the assistance of homology analysis. The novel gene has an open reading frame of 645 bp, and encodes a 214-amino-acid lipase (Lip_BA). The deduced amino acid sequence shows the highest identity with the lipase from B. amyloliquefaciens IT-45 (NCBI database) and belongs to the family of triacylglycerol lipase (EC 3.1.1.3). The lipase gene was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) using plasmid pET-28a. The enzyme activity and specific activity were 250 ± 16 U/ml and 1750 ± 153 U/mg, respectively. The optimum pH and temperature of the recombinant enzyme were 9.0 and 40 °C respectively. Lip_BA showed much higher stability under alkaline conditions and was stable at pH 7.0–11.0. The Km and Vmax values of purified Lip_BA using 4-nitrophenyl palmitate as the substrate were 1.04 ± 0.06 mM and 119.05 ± 7.16 μmol/(ml min), respectively. After purification, recombinant lipase was immobilized with the optimal conditions (immobilization time 3 h at 30 °C, with 92 % enzyme recovery) and the immobilized enzyme was applied in biodiesel production. This is the first report of the lipase activity and lipase gene obtained from B. amyloliquefaciens (including wild strain and recombinant strain) and the recombinant Lip_BA with the detailed enzymatic properties. Also the preliminary study of the transesterification shows the potential value in biodiesel production applications.     

蜡样芽胞杆菌磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中重组表达、纯化及酶学性质分析

【目的】构建蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的重组乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】以B.cereus基因组DNA为模板,PCR扩增得到磷脂酶C基因(bcplc),构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒并转化到乳酸克鲁维酵母中,实现bcplc基因的表达。利用镍柱亲和层析纯化和脱盐柱得到电泳纯的重组磷脂酶C(rbcPLC)。【结果】成功构建产磷脂酶C的重组乳酸克鲁维酵母并纯化了重组磷脂酶C,纯化后rbcPLC经SDS-PAGE分析在40 kDa附近出现显性条带。NPPC法测得rbcPLC酶活为19251 U/mg,最适反应温度为80°C,最适pH为9.0。在低于40°C时,pH 7.0-8.0时,rbcPLC重组酶较稳定。Cu~(2+)和Co~(2+)对其有明显的抑制作用;Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的促进作用。【结论】首次实现了对蜡样芽胞杆菌来源的磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,为其它食品安全性微生物来源的磷脂酶C的研究提供了借鉴意义。     

罗尼氏弧菌Vibrio shilonii BY新琼胶酶基因的克隆、序列分析及表达

【目的】从海洋来源的罗尼氏弧菌菌株BY中克隆得到一个具有琼胶酶活性的新基因,并对其进行重组表达。【方法】对实验室保藏的产琼胶酶菌株BY进行16S rRNA基因序列分析,并构建系统发育树。根据已报道的琼胶酶基因序列的同源性,设计简并引物,利用降落PCR (Touch-down PCR)及染色体步移技术扩增琼胶酶基因序列全长,对基因序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET22a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组酶进行表达,利用DNS法测定了重组酶的酶活,对该重组琼胶酶酶学性质进行研究。【结果】克隆得到一条新的琼胶酶基因,命名为Vibrio sp. BY (GenBank登录号：AIW39921.1),Vibrio sp. BY基因序列全长2 232 bp,编码744个氨基酸,理论分子量为85 kD,Vibrio sp. BY的氨基酸序列基因库中与已知的琼胶酶氨基酸序列Vibrio sp. EJY3的相似度为86%。发酵液琼胶酶酶活力为71.73 U/mL,证明表达的蛋白为琼胶酶。酶学性质研究表明重组琼胶酶的最适温度及pH分别为50 °C和7.0,并且具有较好的稳定性。【结论】利用染色体步移技术克隆得到一条新的琼胶酶基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了重组表达,为琼胶酶的应用奠定了基础。     

黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达

【目的】实现黑曲霉来源的阿魏酸酯酶在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中的组成型表达。【方法】以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板,经重叠延伸PCR扩增得到阿魏酸酯酶基因(AnfaeA),将其与载体pGAP9K相连,构建重组表达载体p GAP9KAnfae A,经SalI线性化后电转入毕赤酵母GS115中,得到重组菌株。高效液相色谱法测定发酵液中阿魏酸酯酶活力,并对重组菌进行了发酵优化。【结果】克隆得到783 bp的阿魏酸酯酶编码基因并实现了其在毕赤酵母中的组成型表达。重组菌发酵84 h后,上清液中酶活达5.72±0.10 U/m L。重组酶(reAnfaeA)经分离纯化后比酶活为59.75 U/mg,大小约为40 k D。发酵优化结果为:葡萄糖40.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,酵母膏30.0 g/L,CaCO_3 0.2 g/L,种龄28 h,接种量3%(体积比),装液量50 m L/250 m L。在此条件下发酵培养,酶活达15.60±0.23 U/m L。【结论】阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达,对研究毕赤酵母组成型表达系统和阿魏酸酯酶的发酵生产具有一定的借鉴意义。     

Cloning,characterization and expression of the extracellular lipase gene from <Emphasis Type="Italic">Aureobasidium </Emphasis><Emphasis Type="Italic">pullulans</Emphasis> HN2-3 isolated from sea saltern

The extracellular lipase structural gene was isolated from cDNA of Aureobasidium pullulans HN2-3 by using SMART^TM RACE cDNA amplification kit. The gene had an open reading frame of 1245 bp long encoding a lipase. The coding region of the gene was interrupted by only one intron (55 bp). It encodes 414 amino acid residues of a protein with a putative signal peptide of 26 amino acids. The protein sequence deduced from the extracellular lipase structural gene contained the lipase consensus sequence (G-X-S-X-G) and three conserved putative N-glycosylation sites. According to the phylogenetic tree of the lipases, the lipase from A. pullulans was closely related to that from Aspergillus fumigatus (XP_750543) and Neosartorya fischeri (XP_001257768) and the identities were 50% and 52%, respectively. The mature peptide encoding cDNA was subcloned into pET-24a (+) expression vector. The recombinant plasmid was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and western blotting and a specific band with molecular mass of about 47 kDa was found. Enzyme activity assay verified the recombinant protein as a lipase. A maximum activity of 0.96 U/mg was obtained from cellular extract of E. coli BL21(DE3) harboring pET-24a(+)LIP1. Optimal pH and temperature of the crude recombinant lipase were 8.0 and 35 °C, respectively and the crude recombinant lipase had the highest hydrolytic activity towards peanut oil.     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

Expression and Biochemical Characterization of a Thermophilic Organic Solvent-Tolerant Lipase from Bacillus sp. DR90

The objective of the present study was the isolation, molecular cloning and biochemical characterization of a thermophilic organic solvent-resistant lipase from Bacillus sp. DR90. The lipase gene was expressed in Escherichia coli BL21(DE3) using pET-28a(+) vector. The purification of recombinant lipase was conducted by nickel affinity chromatography and its biochemical properties were determined. The lipase sequence with an ORF of 639 bp contains the conserved pentapeptide Ala-His-Ser-Met-Gly. His-tagged recombinant lipase had a specific activity of 1,126 U/mg with a molecular mass of 26.8 kDa. The cloned lipase was optimally active at pH 8.0 and 75 °C representing high stability in broad ranges of temperature and pH. High performance liquid chromatography was used to determine the major compounds released during the lipase-catalyzed reaction of p-nitrophenyl derivatives as well as the substrate specificity. The purified lipase showed high compatibility towards various organic solvents, surfactants and commercial solid/liquid detergents; therefore the recombinant DR90 lipase could be considered as a probable candidate for future applications, predominantly in detergent processing industries.