Ri质粒转化桔梗再生植株的研究

本文用具Ｒｉ质粒的发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）的不同菌株通过叶盘法和直接注射法对药用植物桔梗（Ｐ．ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍＡＤＣ）进行感染试验,系统地研究了发根农杆菌诱导桔梗产生毛状根的能力及影响因素,阐明了桔梗的Ｒｉ质粒Ｔ－ＤＮＡ转化体多样性的原因,为转化体的筛选与鉴定提供了依据。还探讨了Ｒｉ质粒做为植物基因工程载体系统的可行性,为进一步开展植物基因工程载体系统的构建提供基础资料。     

发根农杆菌Ri质粒在药用植物生物工程中的应用

发根农杆菌(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ)与根癌农杆菌(Ａ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ)属于根瘤菌科,均为革兰氏阴性菌[1]。它们在侵染植物后引起的症状不同,含有Ｔｉ质粒的根癌农杆菌在侵染植物后形成冠瘿瘤(ｃｒｏｗｎｇａｌｌ),而含有Ｒｉ质粒的发根农杆菌表现与其不同,它在感染植物后在植物的伤口部位诱发产生毛状根(ｈａｉｒｙｒｏｏｔ)。由发根农杆菌侵染植物诱导产生的毛状根具有生长快、分枝多、根毛多等特点。发根农杆菌Ｒｉ质粒与根癌农杆菌Ｔｉ质粒结构相似,都具有高效率转移的Ｔ-ＤＮＡ区和致病的Ｖｉｒ区…     

露水草毛状根的诱导和培养

发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇ６ｎｅｓ）ｐＲｉ１５８３４菌株感染露水草（Ｃｙａｎｏｔｉｓａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ）的茎和根的外植体及小苗,均诱导出毛状根。毛状很能在不含激素的ＭＳ培养基上生长。用纸电泳和高效薄层层析法,在毛状根中检测到甘露碱。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交,在植物ＤＮＡ中检测到ｒｏｌｅ基因。表明Ｒｉ质粒的Ｔ—ＤＮＡ部分已转移到毛状根细胞的ＤＮＡ中。该毛状根能产生β－蜕皮激素。露水草毛状根的诱导培养在单子叶植物中是一个成功的先例。     

植物基因转移及其应用前景

植物基因转移及其应用前景刘金元（山东省农科院原子能应用研究所,济南）自从１９７４年Ｖａｎｌａｒｅｂｅｋｅｔ［１２］等人在根癌农杆菌中发现一种与双子叶植物肿瘤诱导有关的质粒,随后Ｃｈｉｌｔｏｎ［７］等人又从分子水平证实了该质粒中的一个ＤＮＡ片段（Ｔ－Ｄ...     

转移DNA

农杆菌能够将其环状质粒上的一段转移ＤＮＡ(ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ ,Ｔ ＤＮＡ)转移并整合到受体细胞的基因组中 ,并使之携带的基因在受体细胞中表达。利用这种天然载体转化系统 ,除了可以在细菌间进行接合转移外 ,还可以向真菌、放线菌等低等真核生物和许多高等植物基因组转移[1] 。利用人工构建的转移复合物可以将ＤＮＡ转运到哺乳动物的细胞核中[2 ] 。虽然不同农杆菌质粒ＤＮＡ同源性有较大差异 ,但仍有一些共有的保守区段 ,如Ｔ ＤＮＡ区、Ｖｉｒ区、质粒复制起始区、质粒接合转移毒性区等。其中Ｔ ＤＮＡ区和Ｖｉｒ区是与Ｔ ＤＮＡ…     

小鼠金属硫蛋白ⅠcDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ＰＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ＰＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确,再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ＝     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

丛枝菌根真菌与转移Ri T—DNA胡萝卜根器官双重培养的形态学研究

利用双重培养技术,使丛枝菌根真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ侵染转移Ｒｉ Ｔ－ＤＮＡ胡萝卜根器官,建立共生联合体。菌丝对根器官的入侵、在根内的分布、原生质在菌丝内的双向流动、根外辅助细胞形成、菌丝的愈伤现象及孢子的产生、发育和再发芽的形态特征。所形成的形态构造对植物的养分吸收和运输有重要意义。     

影响绿豆下胚轴原生质体遗传转化的因素

采用共培养法和ＰＥＧ法将外源基因导入绿豆下胚轴原生质体中,得到转化愈伤组织。根癌农杆菌经乙酰丁香酮等诱导物质以及低ｐＨ,低ＰＯ４＾３－预培养后,细菌Ｔ－ＤＮＡ的转移受到促进,ＧＵＳ基因表达活性明显提高。在ＰＥＧ介导的绿豆原生质体转化中,高Ｃａ＾２＋／ｐＨ有利于外源ＤＮＡ转移到植物细胞,ＧＵＳ活性较高。此外,质粒ＤＮＡ浓度和启动子类型均对外源基因的转移和表达有一定影响。     

植物基因工程中Ri质粒的研究与应用

近几年来,植物基因工程取得了很大进展,基主要原因是人们采取了有效的基因转移方法。例如截体法;以Ｔｉ质粒,Ｒｉ质料 些病毒,脂质体等做为载体;非载体法有显微注射法,电击法,粒子枪法,花粉管通道法等,在以上诸多方法中,以载体Ｔｉ质粒的研究最为广泛,目前国内外对根癌农杆菌Ｔｉ 粒的研究与应用已目趋成熟,而发根农杆菌Ｒｉ质粒是植物基因工程中的一种新的载体,近几年来的研究表明,Ｒｉ质粒与Ｔｉ质粒是植物基因工     

表达LacZ基因重组火鸡疱疹病毒（HVT）的构建

将不含任何启动子的Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ基因,插入火鸡疱疹平素ＦＣ－１２６株胸苷激酶编码区末尾的ＮｈｅⅠ位点,构建成转移载体质粒ｐＴＫＬａｃＺ。用此质粒和ＨＶＴ感染的细胞基因组总ＤＮＡ共感染鸡胚成纤维细胞,在Ｘ－ｇａｌ存在下,通过蓝斑筛选,分离到重组体ＨＶＴ。ｒＨＶＴ与野生型ＨＶＴ－ＦＣ－１２６株在ＣＥＦ中的生长特性完全相似,且在连续传代过程中能稳定表达ＬａｃＺ基因。     

发根土壤杆菌Ri质粒对黄瓜进行遗传转化的研究

以发根土壤杆菌Ｒｉ质粒介导,对载体ｐＢＴＣ－８上的Ｔ－ＤＮＡ转化黄瓜进行了初步研究。采用黄瓜的各种不同外植体片断与土壤直菌共培养的方法,诱导出具有典型毛状根特性的转化根,转化根经诱导培养形成愈伤组织,冠瘿碱检测表明,转化根及愈伤组织含有农杆碱和甘露碱。愈伤组织进一步分化培养再生出完整植株。再生植株表现卡那霉素抗性。     

紫云英细胞转化条件的研究

研究了紫云英（ＡｓｔｒａｇａｌｕｓｓｉｎｉｃｕｓＬ．）细胞遗传转化的条件。根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）经含乙酰丁香酮的低ｐＨ／ＰＯ３－４ 诱导培养后,用来感染紫云英下胚轴原生质体,随后的细胞ＧＵＳ瞬间表达活性显著提高,间接证明了上述预培养诱导活化了细菌ｖｉｒ基因,促进了Ｔ－ＤＮＡ 向植物细胞转移。在ＰＥＧ介导的ＤＮＡ 转移中,较高的ｐＨ 和Ｃａ２＋ 浓度能够提高细胞ＧＵＳ活性。质粒ＤＮＡ 浓度及启动子类型对外源基因在植物细胞内表达也有一定影响。采用外植体－农杆菌共培养法,获得ＧＵＳ和ＮＰＴ Ⅱ基因稳定表达的紫云英转化植株     

黄瓜Ri T—DNA转化根的植株再生

本文利用发根农杆菌感染黄瓜植体得到的转化根,在不同激素配比的分分培养基上培养,进行再生植株的诱导试验,结果表明,ＮＡＡ和ＢＡ的合适配比,有利于黄瓜植株的再生,转化根及其再生植株检测到冠瘿碱的存在,说明农杆菌Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ已转移到黄瓜基因组中。     

丛枝菌根的双重培养方法及其菌丛际的建立

成功地建立超丛枝菌根真菌Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ与转移Ｒｉ Ｔ－ＤＮＡ胡萝卜根器官的双重培养体系,且在此基础上将根与菌丝分隔开来（两室系统）,在人工培养条件下形成了无杂菌的菌丝际环境。菌丝际的建立为研究菌丝的生理、生化特性奠定了基础。     

发根农杆菌及其应用

农杆菌是一类侵染性非常广泛的Ｇ-土壤杆菌,农杆菌质粒介导的基因转移系统是植物基因工程中比较完善与有效的基因转移方法。在众多的转基因植物中有80%是由农杆菌介导转化的,但其中大部分是有根癌农杆菌Ｔｉ质粒介导法获得的。根癌农杆菌含有的Ｔｉ质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤。发根农杆菌含有Ｒｉ质粒,侵染植物后能诱发植物细胞产生毛发状根,即发根瘤。近年来的研究发现发根农杆菌Ｒｉ质粒介导法比Ｔｉ质粒法具有一定优越性而被广泛重视,而且由其转化获得转基因植物和生物有效成分的报道愈来愈多,本文主要讨论发根农…     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ,Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ,简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。     

一种移码差错率大幅度下降的聚合酶N端缺失体的研究

采用双引物定变法,构建了以２３６位氨基酸为起始密码子的Ｔａｑ酶的高表达质粒,并以－１移码突变质粒ｐＦＤＰＭ１１８作为模板,建立了测定ＤＮＡ聚合酶的体外合成精确性的Ｇａｐｐｅｄ－ＤＮＡ系统。通过转化大肠杆菌ＴＧ１菌株皇计数Ｘ－ｇａｌ平板上蓝白菌落的比例,测定了Ｔａｑ和ＴａｑＮＤ２３６两种ＤＮＡ聚合酶在ＤＮＡ体外合成中的称码突变率,发现缺失后的ＴａｑＮＤ２３６复制精确性提高了１０倍以上。     

A组轮状平素我国地方株VP6基因的序列测定及其在杆状病毒系统中的表达

通过反转录－聚合酶链反应获得了轮状病毒地方株Ｔ１１４ ＶＰ６全基因的ｃＤＮＡ片段,将其克隆入转移载体质粒ｐＶ Ｌ１３９３中,构建成重组质粒ｐＶＬ１３９３－ＶＰ６。对克隆的ＶＰ６基因进行序列测定,并且它和杆状病毒野毒株和ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,筛选纯化得到含ＶＰ６基因插入片段的重组杆状病毒,并进行了表达重组蛋白ＶＰ６的检测。     

小鼠金属硫蛋白──I cDNA在蓝藻中的克隆和表达

生物工程技术在工业、农业和环境保护上的应用日益广泛,将工程微生物应用于环境污染的治理,是一条快速、安全又经济的途径。本文报道了获得一种清除重金属污染工程藻的研究。将小鼠金属硫蛋白－Ｉ（ｍｏｕｓｅｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ－Ｉ,ｍＭＴ－Ｉ）ｃＤＮＡ基因片段插入到质粒ｐＲＬ４３９上的强启动子ＰｐｓｂＡ之后,并与穿梭载体ｐＤＣ－８相连构建成功大肠杆菌──蓝藻穿梭表达载体ｐＤＣ－ＭＴ,然后通过三亲结合转移法将ｐＤＣ－ＭＴ转入固氮丝状体蓝藻鱼腥藻（Ａｎａｂａｅｎａ）７１２０中,经新霉素筛选获遗传稳定的转外源ＤＮＡ藻株;纯化单藻落扩大培养后,提取蓝藻质粒,斑点杂交确定ｍＭＴ－ＩｃＤＮＡ的转人;在培养基中加入重金属Ｃｄ,培养后收集藻细胞,用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ,极谱法和原子吸收等多种方法确定金属硫蛋白的表达,并计算表达量约为４０μｇＭＴ／ｇ藻鲜重。