枯草杆菌复制始区主要核糖体蛋白质基因群中两个新突变的遗传研究

我们分离到19株螺旋霉素抗性(spi~R)突变体和49株核糖霉素抗性(Rib~R)突变体。其中有5株带有改变的核糖体蛋白质,这些蛋白质是:S4,S5,L18,L23和L13,它们的改变同抗菌素抗性表型没有因果关系。遗传定位spi和rib在主要核糖体蛋白质基因群中,基因排列的顺序是:cysA—rib—rpsL—spi—ts-5—rpsC—rpsE—ts。L23蛋白质基因也在rpsL—rpsC区,L18蛋白质基因不在这一区域内。带有L18蛋白质基因突变的SP4菌株的大分子合成速率都比对照菌株低,而仅带有L23蛋白质基因突变的TDL23菌株,RNA合成速率降低,蛋白质合成速率与对照菌株相差不大,这是TDL23的mRNA合成蛋白质能力提高的结果。     

螺旋霉素生物合成中的分子、基因及发酵调控技术

螺旋霉素(spiramycin,SPM)是十六元环大环内酯类抗生素,在临床上占有重要的地位,其产生菌为生二素链霉菌(S.ambofaciens)。螺旋霉素由福洛氨糖(forosamine)、碳霉氨糖(mycaminose)和碳霉糖(mycarose)3个部分组成。简要介绍了螺旋霉素的理化性质和药理作用,以及生物合成途径与发酵工艺等方面的研究状况,根据螺旋霉素生物合成途径,分别从分子水平、基因水平及发酵工艺等3个方面对通过添加前体或对前体有利的物质及定向过量表达某些重要基因等提高螺旋霉素产量的技术进行了简要概述。     

铵离子对必特螺旋霉素组分生物合成的调控作用

通过考察铵离子浓度对必特螺旋霉素组分的影响,证实低浓度铵离子的培养条件可以有效提高必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例。在此基础上进一步测定了高铵(62·5mmol/L)和低铵(2·5mmol/L)培养条件下的糖、铵离子、相关有机酸、缬氨酸脱氢酶酶活等中间代谢数据,结果表明高浓度铵离子培养条件下,必特螺旋霉素产生菌中亮氨酸分解代谢途径的关键酶——缬氨酸脱氢酶的活性低于低铵对照试验,造成异戊酰螺旋霉素合成过程中酰基转移反应的底物——异戊酰CoA的相对不足,从而导致异戊酰螺旋霉素组分的降低。大幅度降低铵离子浓度至2·5mmol/L,使异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例从5·43%提高至28·59%。但氮源的不足影响了必特螺旋霉素的产量,低铵条件下的效价为107μg/mL,相对高铵条件下降了14·4%。在低铵培养条件的基础上添加亮氨酸,可以进一步改善必特螺旋霉素的组分,异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例增至37·84%。     

金霉素链霉菌无活性菌株回复突变的研究

近年来,在有关抗菌素合成途径的研究中,报道了由于产生遗传性障碍而不能合成抗菌素,亦即产生了“零”突变菌株。又在次级代谢途径障碍性菌株的回复突变研究中,报道了能使抗菌素产量大幅度提高的回复突变型菌株。我们在对产金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)菌株进行诱变试验中,筛选到一些     

基于液质联用技术解析和降低螺旋霉素发酵杂质

目前螺旋霉素生物合成的发酵杂质含量过高 ,导致成品收率过低 ,杂质含量不符合药典规定。为解决这一问题 ,首先利用LC -MS联用技术定性分析了 4种螺旋霉素发酵杂质的结构 ,结合螺旋霉素生物合成途径分析 ,它们都起因于螺旋霉素生物合成糖基化过程的紊乱。氮源尤其是铵盐对螺旋霉素生物合成糖基化过程有重要的调节作用。进一步的氮源优化使螺旋霉素发酵液中 4种杂质含量降低 22%～88% ,杂质含量全部低于欧洲药典标准。     

全国抗菌素学术会议征集论文

由中国药学会和中国微生物学会联合主办的全国抗菌素学术会议,将于今年十月在广西桂林召开。代表名衙约100人尼右,名额的分配主要根据论文评选结果。会议内容:①开展抗菌素学科各专业(包括新抗菌素筛选、半合成抗菌素、抗菌素生产、临床、基础理论及农牧用抗菌素的学术交流;②专题报告;③成立中国     

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元环大环内酯类抗生素, 并且结构非常相似。螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C3上的一个取代基的差异, SP I组分为羟基、SP II组分羟基乙酰化、SP III组分羟基丙酰化; 麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素, 麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基。已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成。本研究将螺旋霉素产生菌—Streptomyces spiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后, 发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分, 并且螺旋霉素III组分也不是主要组分, 说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌—S. spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性, 也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关。     

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中的酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元大环内酯类抗生素,并且结构非常相似.螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C<,3>上的一个取代基的差异,SPⅠ组分为羟基、SPⅡ组分羟基乙酰化、APⅢ组分羟基丙酰化;麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素,麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基.已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成.本研究将螺旋霉素产生菌-Streptomycesspiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后,发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分,并且螺旋霉素Ⅲ组分也不是主要组分,说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌-S.spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性,也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关.     

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

利用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mPt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt.S.lividans TK24(p.WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89.02％和58.53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。     

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素（SP）为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C₃上分别连接羟基（SPⅠ）、乙酰基（SPⅡ）和丙酰基（SPⅢ）;SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR（single oligonucleotide nested PCR）方法,从螺旋霉素产生菌S. spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因（sspA）及其侧翼序列,共约4.3kb（其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742）。采用DNA同源双交换技术对S. spiramyceticusF21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明：原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72％、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。     

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素（SP）为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C₃上分别连接羟基（SPⅠ）、乙酰基（SPⅡ）和丙酰基（SPⅢ）;SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR（single oligonucleotide nested PCR）方法,从螺旋霉素产生菌S. spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因（sspA）及其侧翼序列,共约4.3kb（其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742）。采用DNA同源双交换技术对S. spiramyceticusF21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明：原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72％、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。     

Mn2+对必特螺旋霉素产生菌代谢和必特螺旋霉素合成的影响

通过在必特螺旋霉素产生菌WSJ 1 195发酵过程中添加金属离子Mn2 发现 :发酵前期 (2 4h左右 )添加Mn2 可以明显提高生物效价 ,加入的Mn2 浓度以 5mmol L为最佳。实验显示添加Mn2 后发酵液pH逐渐下降 ,整个产素期间pH一直低于对照 ;与对照相比添加Mn2 摇瓶菌体浓度也较低。通过研究必特螺旋霉素发酵过程有机酸的变化趋势发现 :2 4h添加 5mmol LMn2 后发酵过程中有机酸含量已经发生变化 ,其中丙酸浓度的增长最为显著 ,84h时其浓度为对照的 6倍。通过丙酸盐的添加实验证实了发酵前期添加Mn2 可以促进产物合成的原因之一是促进了丙酸等前体酸的合成 ,丰富了大环内酯合成的前体库     

埃莎霉素Ⅰ组分高含量、高产量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鉴定

【目的】利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点,将ist与调节基因acyB2在异戊酰螺旋霉素(埃莎霉素)Ⅰ产生菌菌株中共表达,获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。对其及原始螺旋霉素产生菌菌株Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。【方法】从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。【结果】两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致,在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上,并且与不同基因的相近菌株各有不同,其中无一报道产生螺旋霉素。【结论】Streptomyces spira-myceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种,16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素Ⅰ基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。     

埃莎霉素I组分高含量、高产量基因工程菌WSJ-IA及其原株的鉴定

【目的】利用调节基因acyB2激活异戊酰基转移酶(ist)基因表达的特点, 将ist与调节基因acyB2在异戊酰螺旋霉素(埃莎霉素)Ⅰ产生菌菌株中共表达, 获得埃莎霉素Ⅰ单组分的高含量及高产量菌株WSJ-IA。本研究对其及原始螺旋霉素产生菌菌株Streptomyces spiramyceticus F21进行了初步鉴定。【方法】从形态学、培养和生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列、5个看家基因(atpD、gyrB、rpoB、recA和trpB)蛋白分析和系统发育树构建等方面对该菌株及其原株进行了鉴定。【结果】两株菌在形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成、16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平基本一致, 在系统发育树分析中同处在一个分支中。而在16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育上它们均与已知相近菌株处于不同的分支上, 并且与不同基因的相近菌株各有不同, 其中无一报道产生螺旋霉素。【结论】Streptomyces spiramyceticus F21可能是一个产生螺旋霉素的链霉菌新种, 16S rRNA基因序列和5个看家基因蛋白序列分析可以作为埃莎霉素I基因工程菌生产过程中进行鉴别的分子标志。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mpt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt．S．Lividans TK24(p．WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89．02％和58．53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S．Spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。     

丙酰螺旋霉素基因工程菌构建的研究

将含有丙酰化酶基因的pIJM9重组质粒转化至螺旋霉素生产菌株S.spiramyceticus获得的转化子,经菌落康位杂交和Southern分子杂交表明,No．6l转化子含有pIJM9重组质粒,其发酵产物经薄层层析,生物显迹试验证明,含有与丙酰螺旋霉素标准品R,值相类似的组分,高压液相色谱分析也证明其产物中有与丙酰螺旋霉素保留时间基本一致的成份,质谱分析结果表明产物中含有与丙酰螺旋霉素Ⅱ相同的组分,这说明No．61克隆菌株是能够直接产生丙酰螺旋霉素的基因工程菌。     

一株产生螺旋霉素的链霉菌新种

从甘肃省永昌县土壤中分离得到一株产生螺旋霉素的链霉菌L7990该菌株孢子丝螺旋形,孢子长方形,表面有疣状凸起并带有粗短小刺。在大多数培养基上气生菌丝体淡紫灰色,基内菌丝体葡萄酱紫色。与文献报道的螺旋霉素产生菌S. ambfacicns 比较,有明显的不同。与国外报道的几个近似种比较也不相同。因此,定为新种,命名为螺旋霉素链霉菌Streptomycesspiramyceticus n. sp. Yan et Yu, 1979。     

G418抗性筛选标记在酵母体系中的应用

 <正> G118是一种氨基苷类抗菌素衍生物,对原核和真核细胞均有毒性作用,能阻断细胞内蛋白质合成。将G418抗性neo基因引入细胞后,neo基因即能编码产生氨基糖苷类3’-磷酸转移酶Ⅰ,它能失活几种不同的2-脱氧链霉氨基糖苷类抗菌素,使其在3’羟基部位磷酸化,     

耐热链霉菌4″-O-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因(ist)表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因(mpt)外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到S.lividans TK24中。通过测定S.lividans TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒S.lividans TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。