实时荧光PCR在呼吸道感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的临床应用

目的评价实时荧光PCR(RT-PCR)用于检测呼吸道感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的方法学特性,为临床快速诊断呼吸道MRSA定植或感染提供可靠循证依据。方法通过RT-PCR技术对痰液标本中金黄色葡萄球菌(SA)特异性核酸酶编码基因nuc和MRSA的特异性耐药基因mec A进行定量检测,并同时以细菌培养、鉴定和MRSA耐药表型确诊实验作为参考方法,评价其灵敏度、特异度、阴阳性预测能力;用10倍梯度稀释法配制已知标准菌株菌悬液评估RT-PCR的最低检出限。结果 RT-PCR法较细菌培养法对MRSA检测的总符合率为97.5%,检测SA的敏感度为97.2%、特异度为98.2%、阳性预测值为92.1%、阴性预测值为99.4%,检测甲氧西林耐药性的敏感度为100%、特异度为97.7%、阳性预测值为85.2%、阴性预测值为100%;RT-PCR对nuc基因和mec A基因的最低检出限均为103/m L。结论RT-PCR法与细菌培养法对于检测MRSA差异无统计学意义,且灵敏度优于后者,是用于临床快速排除性筛查呼吸道感染MRSA的较佳检测方法。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌染色体盒的研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的产生是由甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）获得外源性的SCCmec所致。MRSA菌株可以产生一种新的青霉素结合蛋白PBP2a,PBP2a降低了与β-内酰胺类抗生素的亲合力,从而对β-内酰胺类抗生素产生耐药性。PBP2a由mecA基因编码,mecA基因存在于葡萄球菌盒式染色体（Staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec）中,SCCmec是一种可移动的遗传元件,该元件还携带除mecA基因外的其他抗菌药物的耐药基因,造成多重耐药（Multidrug-resistance,MDR）。SCCmec目前主要分为8型,其中又分为若干亚型。SCCmec的基因型与MRSA的流行背景有关,不同地区的SCCmec基因分型分布可能不同。     

社区获得性和医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PVL基因检测

目的 调查本地区患者各种标本中分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的杀白细胞素(PVL)基因携带情况,为临床MRSA的治疗及流行病学调查提供合理的依据.方法 对所分离的MRSA菌株进行药敏试验分析,同时采用PCR法检测mecA基因和PVL基因,比较社区获得性MRSA (CA-MRSA)和医院获得性MRSA (HA-MRSA)之间耐药性的比较及PVL基因携带率的比较.结果 对不同来源的9l株MRSA分离株耐药性分析,CA-MRSA对环丙沙星、利福平、庆大霉素和左旋氧氟沙星的敏感性明显高于HA-MRSA.经PCR检测发现,所有菌株均携带有mecA基因,21株携带有PVL基因,其中65株HA-MRSA有仅8株携带有PVL基因,而26株CA-MRSA中有13株携带有PVL基因,携带率差异有统计学意义.结论 本地区CA-MRSA是携带PVL基因的主要菌株,HA-MRSA对抗菌药物的耐药性明显高于CA-MRSA,尚未发现对万古霉素和替考拉宁的耐药菌株.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型研究进展

近年来,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在全世界各地感染率和分离率不断提高,已成为目前院内感染的重要病原菌之一。运用有效、可靠、廉价的分子分型方法对分析耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行病学特征及来源,对制定控制院感及流行的措施非常重要的。本研究概述了各种分子分型方法的原理及比较,如SCCmec分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、葡萄球菌A蛋白分型和毒力因子分型等。脉冲场凝胶电泳仍然是暴发流行中MRSA分子分型的金标准,而其他分型方法更适合用于检测菌株的变异和建立国际监测。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药及其检测方法

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是引起医院感染的多重耐药菌,其有效的治疗药物为万古霉素。近年已发现对万古霉素耐受的金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌一旦对万古霉素耐药,临床将面临无药可供选择的局面。由于其所造成治疗上的困难,对其耐药机制的深入研究和该菌准确、及时的检出对于寻找新的治疗靶位和防止其播散有着极其重要的意义。本文就mecA耐药决定子、调节基因、染色体上的辅助基因对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药表达的影响及其表型和基因检测方法作一综述。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测和分型方法研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Methcillin - resistantStaphylococcus aureus,MRSA )引起的院内感染 (nosocomialinfection)已经成为全世界一个越来越严重的问题。要想尽快获得 MRSA的相关信息从而采取适当的控制感染的措施 ,就必须依靠快速、可靠的检测和分型方法。由于 MRSA对甲氧西林耐药性的不断变化 ,故虽然目前存在检测和分型方法很多 ,但仍很难提供一种最优方法。在这里 ,我们对多种方法进行了比较 ,以便大家能从中选出既准确又省时且适合自己实验室使用的检测的分型方法。1　检测方法1.1　完整结构水平1.1.1琼脂平皿 2倍稀释法…     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因与消毒剂抗性的研究

摘要：目的 了解临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐消毒剂基因携带状况及其对消毒剂抗性水平。方法 采用聚合酶链反应（PCR）法和体外抗菌试验方法进行实验室检测。结果 10株临床分离的MRSA中,检出4株携带qacA/B基因,检出率为40.0%。含氯消毒剂对4株qacA/B基因阳性MRSA的MIC值均高于标准菌株。戊二醛消毒剂对2株MRSA基因阳性MRSA的MIC值和1株MRSA基因阳性MRSA的MBC值高于标准菌株,其他均与标准株相同。结论 临床分离的MRSA qacA/B基因阳性率较高,携带qacA/B基因阳性的MRSA对含氯消毒剂有产生抗性的趋势。     

耐甲氧西林葡萄球菌感染的调查与分析

目的调查住院患者耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococci,MRS)的感染情况,以便采取有效的防治措施。方法收集临床分离菌株,用mecA基因PCR扩增法鉴定MRS,并结合临床资料对本院MRS感染进行回顾性调查研究。结果住院患者标本中共收集到68株葡萄球菌,其中MRS 38株(阳性率为55.9%)。MRS感染主要多发于年龄>60岁,男性,合并多种疾病患者,科室分布以呼吸内科、泌尿外科及ICU病房为主。药敏结果显示MRS对万古霉素、利奈唑烷及喹努普汀的敏感率为100%,对替考拉宁敏感率为94.7%,对利福平的敏感率为57.9%,其余抗菌药物敏感率均<30%。结论及时了解本院患者MRS感染分布及耐药情况,有助于我们采取相应的监测及防治措施。     

ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因检测与感染控制

目的:研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)SCCmec基因分型情况并对其耐药谱进行分析。方法:收集临床标本522例,应用多重PCR法对MRSA进行SCCmec基因分型,采用全自动微生物鉴定药敏分析仪进行细菌的鉴定及药敏试验,部分药敏试验采用K-B法。结果:522例中分离出146例MRSA,其中10株为SCCmec I型(6.84%),29株为SCCmec II型(19.86%),103株为SCCmecⅢ型(70.55%),未分型4株(2.74%)。MRSA分离株对奎奴普汀/达福普汀、替考拉宁、复方磺胺甲恶唑、万古霉素和利奈唑胺敏感,SCC mecII型与SCC mecIII型对氯霉素的耐药率分别为27.59%和11.65%,对利福平的耐药率分别为13.79%和2.91%,存在明显的差异性(P0.05),其余均呈高水平耐药。146例MRSA患者中治愈52例,占35.62%;感染相关死亡者12例,占8.22%。结论:ICU耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因检测以SCC mecIII型为主,且对抗菌药物呈多药耐药。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学研究

了解我院患者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的分子流行病学特点,为临床抗感染治疗提供依据。收集2007年1月~2008年9月我院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌共54株,采用PCR进行SCCmec基因分型、葡萄球菌A蛋白（SPA）分型,并检测杀白细胞毒素（PVL）基因,同时应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行同源性分析。54株MRSA菌株SCCmec基因分型为SCCmecⅡ型17株,SCCmecⅢ型33株,SCCmecⅣ型2株,SCCmecⅤ型2株;SPA基因分型将28株归属为t030,9株为t002,8株为t037,5株为t570,2株为t437,t163和t796各1株;PVL毒素检测只有2株SCCmecⅣ型菌株阳性;PFGE证实院内MRSA感染主要为2种克隆株传播,同时还有其他型别出现。本院MRSA流行传播的SCCmec基因型主要以Ⅲ型占优势,同时发现有携带PVL毒素的CA-MRSA分离株流行,应引起密切关注。     

2008-2010年舟山某院金黄色葡萄球菌的分布及耐药性变迁

目的 分析舟山医院三年来金黄色葡萄球菌分布及耐药性变迁,并对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的耐药性差异做对比.方法 用ATB Expression半自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验,用K-B法测红霉素、克林霉素、头孢西丁、苯唑西林直径,比较耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)的耐药性差异.结果 金黄色葡萄球菌对苯唑西林、庆大霉素、红霉素、四环素和克林霉素的耐药率有上升的趋势;MRSA对苯唑西林、庆大霉素、复方新诺明、克林霉素、红霉素、青霉素、喹奴普汀-达福普汀、利福平和四环素的耐药率都明显高于MSSA的耐药率,二者间差异有统计学意义(P＜0.01),D-试验阳性71株,占72.45％.结论 金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐升高,特别是对MRSA应引起临床的重视,检测克林霉素诱导型耐药具有重要的临床应用价值.     

区级医院重症监护病区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的调查和分析

目的通过对区级医院重症监护病区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的流行初期进行调查和分析,以防止MRSA的暴发流行以及能够采取有效治疗措施。方法对2006年12月至2007年1月区级医院重症监护病区患者、医务人员及物体上送检标本中被MRSA感染的病例进行调查和分析。结果从重症监护病区患者、工作人员及物体上采集标本MRSA的感染阳性率分别为25%~47.6%、0%和20%。结论此次有局部暴发趋势的MRSA感染由于发现及时、措施得当被控制住。医院必须加强监督抗生素的合理用药和耐药性的检测,严格医务人员洗手及实行消毒隔离措施,切断传播途径,防止MRSA感染在医院的发生和流行。     

免疫捕获PCR法快速检测金黄色葡萄球菌

旨在建立一种快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)免疫捕获PCR技术,并探讨其灵敏度和特异性。SA特异性抗体包被PCR管以富集待测样品中目标菌,之后在同一PCR管里直接进行免疫捕获PCR,并和直接PCR比较。免疫捕获PCR法可特异性检测2株SA菌株,而无法检测到其它8种常见食源性致病菌,说明该方法对SA具有良好的特异性;该方法对纯菌液而言,检测灵敏度可达到2.35×102CFU/mL,是直接PCR的100倍;对5种食品模拟带菌检测发现,无需增菌培养,其灵敏度可达到2.35×103-2.35×104CFU/mL,是直接PCR的10-100倍。免疫捕获PCR法集免疫学与分子生物学检测技术于一体,具有高特异性、高灵敏度、检测快速、易于操作、成本低廉等诸多优点,是一种适合基层实验室使用的检测技术。     

Impact of sar and agr on methicillin resistance in Staphylococcus aureus

Abstract The global regulators agr and sar control expression of cell wall and extracellular proteins. Inactivation of either sar and/or agr in a typical heterogeneously methicillin-resistant Staphylococcus aureus resulted in a small but reproducible decrease in the number of cells in the subpopulation expressing high methicillin resistance. The amount of low affinity penicillin-binding protein PBP2', the prerequisite for methicillin resistance, was apparently not affected, however, a reduction in PBP1 and PBP3 production was observed, suggesting that these resident PBPs of the cells might be involved somehow together with PBP2' in high level methicillin resistance.     

Rapid detection of mecA and spa by the loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) method

Aim: To develop a detection assay for staphylococcal mecA and spa by using loop‐mediated isothermal amplification (LAMP) method. Methods and Results: Staphylococcus aureus and other related species were subjected to the detection of mecA and spa by both PCR and LAMP methods. The LAMP successfully amplified the genes under isothermal conditions at 64°C within 60 min, and demonstrated identical results with the conventional PCR methods. The detection limits of the LAMP for mecA and spa, by gel electrophoresis, were 10² and 10 cells per tube, respectively. The naked‐eye inspections were possible with 10³ and 10 cells for detection of mecA and spa, respectively. The LAMP method was then applied to sputum and dental plaque samples. The LAMP and PCR demonstrated identical results for the plaque samples, although frequency in detection of mecA and spa by the LAMP was relatively lower for the sputum samples when compared to the PCR methods. Conclusion: Application of the LAMP enabled a rapid detection assay for mecA and spa. The assay may be applicable to clinical plaque samples. Significance and Impact of the Study: The LAMP offers an alternative detection assay for mecA and spa with a great advantage of the rapidity.     

金黄色葡萄球菌儿童临床分离株携带PVL基因状况的分析

目的了解金黄色葡萄球菌儿童分离株携带Panton-Valentine杀白细胞素（PVL）基因的状况及感染类型。方法采用多重PCR同时检测金黄色葡萄球菌16SrRNA基因、PVL基因和mecA基因;多重PCR检测MR—SA的SCCmec基因型及亚型。结果66株金黄色葡萄球菌JL童临床分离株经多重PCR检测,其中MRSA有7株（10．6％）,MSSA有59株（89．4％）;携带PVL基因金黄色葡萄球菌有31株,总阳性率为47．O％（31／66）,其中2株为MRSA,29株为MSSA,阳性率分别为28．6％（2／7）和49。2％（29／59）。2株MRSA都属于SCCmecIV型;31株PVL基因阳性分离株有21株分离自脓液,7株分离自血液,仅1株分离自痰液。结论儿童MSSA是携带PVL基因的主要菌株,携带PVL基因的金黄色葡萄球菌主要引起化脓性感染和血流感染。     

MRSA中mecA及femB基因的检测与耐药相关性

研究femB、mecA基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的表达与耐药的关系.运用PCR对MRSA的femB、mecA基因进行检测,MRSA耐药检测采用头孢西丁纸片法.40 株金黄色葡萄球菌(下简称金葡菌)通过头孢西丁纸片法,检出 30 株耐头孢西丁的菌株,通过PCR检测这 40 株金葡菌mecA基因,30 株MRSA全部为阳性, femB基因在 30 株MRSA中全部表达,而甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)的未表达.结果可见,PCR能快速准确地鉴定MRSA, mecA基因是MRSA的耐药基因,femB基因是MRSA的耐药相关基因.     

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法

[目的]金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值.[方法]对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RTˉ,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1 E)ˉ△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RTˉ样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RTˉ样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参.[结果]采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNA Ⅲ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p＞0.05).[结论]这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析.