解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变,限制性内切酶切割的拼接,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

解脂耶氏酵母tsr1突变体的构建*

将解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的ＴＳＲ１基因编码区部分缺失的ＤＮＡ片段转化一株解脂耶氏酵母。通过体内同源重组,部分缺失的外源ｔｓｒ１片段取代了酵母染色体上的正常的ＴＳＲ１基因,从而获得ｔｓｒ１的转化子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,用该法成功地构建了ｔｓｒ１突变体,这为进一步研究解脂耶氏酵母ＴＳＲ１基因的功能奠定了基础。     

解脂耶氏酵母TSR1基因的定点诱变*

对解脂耶氏酵母与蛋白质分泌有关的TSR1基因进行寡核苷酸介导的定点诱变 ,限制性内切酶切割和拼接 ,得到了该基因的一系列缺失突变体。这为进一步研究TSR1基因不同结构域的功能奠定了基础。     

解脂耶氏酵母表达系统研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是非常规酵母中具代表性的一种,它底物广泛,尤其能利用有机酸（柠檬酸、异柠檬酸）,蛋白类（蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α-甘露糖苷酶、RNase）。烷烃类廉价物质作为底物分泌大量的代谢产物,自上世纪40年代被发现以来,越来越受到研究者的重视,并于上世纪90年代被开发成为一种新的酵母表达系统,用于42种异源蛋白的高效表达。综述了解脂耶氏酵母表达系统及其特点,有利于研究者从转录和翻译的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径以及寻找到调控型启动子。     

植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母po1h中的表达

本实验通过PCR方法从毕赤酵母GS115-phyA中扩增出不含有信号肽及内含子的黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因,并将其克隆到表达载体pINA1297中,得到表达载体pINA1297-phyA,利用醋酸锂转化法将线性化载体转化到解脂耶氏酵母po1h中,通过YNBcasa和PPB平板筛选出阳性表达菌株,阳性菌株在YM培养基中28℃培养6d后酶活达到最大为636.23U/mL。表达上清经SDS-PAGE分析得到表达植酸酶分子量约为130kDa,但通过去糖基化处理后其分子量变为51kDa,与理论值相符。经过酶学性质分析表明重组植酸酶最适pH为5.5,最适温度为55℃,该酶在pH2.0~8.0处理1h后仍有较高酶活,并且90℃处理10min后还有86.08%的残留酶活,其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也较强。     

解脂耶氏酵母新型表达载体构建及癌基因rho在其中的表达

为了简化解脂耶氏酵母表达载体构建过程、消除抗生素污染,将mel基因(编码酪氨酸酶)作为新型报告基因用于构建新型酵母表达载体,利用组装PCR人工合成基因mel,并用重叠PCR将其与同源组成型强启动子p TEF、分泌性信号肽XPR2pre及强终止区LIP2t融合,构建新型胞外及胞内表达载体,并利用其在解脂耶氏酵母野生菌株中表达人源癌基因rho.成功获得mel全基因并将其与启动子、信号肽和终止区融合,得到融合片段TXML,用其替换原有表达载体的筛选标记基因ura3d4,构建得到新型胞外及胞内表达载体pINA1297-M和pINA1297-a-M,转化后的酵母阳性转化子性状明显,随后利用此新型表达系统获得可溶性异源蛋白Rho.首次实现了将mel作为一种便捷、价廉、无污染的新型筛选标记基因运用于非常规酵母表达系统中,更为mel在其它真核表达系统中的运用奠定了技术基础;获得的可溶性Rho蛋白可为研究其性质、结构、功能及与Rho癌基因家族其它成员的相互作用提供条件.     

解脂耶氏酵母合成萜类化合物的研究进展

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种遗传背景清晰、基因编辑工具完备的非常规油脂酵母。萜类化合物是以异戊二烯为基本结构单元,广泛存在自然界的天然次级代谢产物。近年来随着合成生物学的高速发展,代谢工程改造解脂耶氏酵母合成萜类化合物越来越受到人们的关注。本文从增强前体供应、亚细胞器合成和碳源利用等方面对代谢工程改造解脂耶氏酵母合成萜类化合物进行综述,并对未来可能的研究方向进行展望,为后续研究工作提供参考。     

代谢工程改造解脂耶氏酵母合成羧酸的研究进展

解脂耶氏酵母是一种具有独特生理代谢特征的非常规酵母.它具有可以利用多种廉价碳源、低pH值耐受性好、分泌能力强等优点,因此非常适合用于各种工业产品的微生物发酵.目前,解脂耶氏酵母已被证实具有高效生产多种(同源或异源)有机羧酸的能力.本文对近年来利用代谢工程及合成生物学技术改造解脂耶氏酵母生产羧酸的实例进行了总结,并重点介...     

解脂耶氏酵母中羽扇豆醇合成途径的构建与调控

羽扇豆醇因其具有抗癌抗炎等生理活性而广泛应用于医药领域.本研究分别利用源自木榄和蓖麻的羽扇豆醇合酶(LUS)在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中构建生物合成羽扇豆醇途径(GLU-1、GLU-2),并由对该途径中关键限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(tHMGR)和异戊烯基二磷酸异构酶(ID...     

代谢工程改造解脂耶氏酵母合成植物萜类化合物的研究进展

萜类化合物是一类广泛存在于植物中的天然产物,其在食品、药品和化工等多个领域中均有广泛的用途,市场潜力巨大.因此,开发生产萜类化合物等植物天然产物可再生的微生物资源来补充甚至代替原有稀少和珍贵的植物资源,具有重要的理论意义和潜在的应用价值.解脂耶氏酵母是目前使用最广泛的非常规酵母底盘细胞之一.近年来,利用代谢工程及合成生...     

LeCOP1LIKE基因的克隆、反义构建及微型番茄的转化

本文报告利用EST筛选结合RT-PCR的方法从番茄中克隆了LeCOP1LIKE基因的1060bpcDNA片段,并利用其非保守域构建反义RNA表达载体。利用农杆菌介导法．将LeCOP1LIKE基因的反义RNA表达载体转入微型番茄Micro-Tom．获得了10株反义LeCOP1LIKE转基因微型番茄。RT-PCR分析表明其中4个转基因株系中的LeCOP1LIKE表达被显著抑制．并发现抑制LeCOP1LIKE基因的表达导致转基因番茄的株高下降、叶片的叶绿素含量提高、果实中番茄红素含量增加,并且明显抑制转基因种子的发育。这些实验结果证明了LeCOP1LIKE基因为番茄发育过程中光形态建成的抑制因子。     

The regulatory subunit of protein kinase A promotes hyphal growth and plays an essential role in Yarrowia lipolytica

The gene encoding the regulatory subunit (RKA1) of the cAMP-dependent protein kinase (PKA) of Yarrowia lipolytica was isolated to analyze the role of the PKA pathway in the dimorphic transition of the fungus. The gene encoded a protein of 397 amino acids that exhibits significant homology to fungal PKA regulatory subunits. Attempts to disrupt the gene by double homologous recombination, or the Pop-in Pop-out technique, were unsuccessful. The gene could be mutated only in merodiploids constructed with an autonomous replicating plasmid. Loss of the plasmid occurred with growth under nonselective conditions in the whole population of merodiploids carrying the mutation in the plasmid, but in merodiploids with the mutation at the chromosome, a resistant population prevailed. These data suggest that RKA1 is essential in Y. lipolytica. cAMP addition inhibited the dimorphic transition of the parental strain, but merodiploids carrying several copies of RKA1 were more resistant to cAMP. These results, and the observation that RKA1 was upregulated in mycelial cells, indicate that an active PKA pathway promotes yeast-like growth and opposes mycelial development. This behavior is in contrast to that of Candida albicans, where the PKA pathway favors hyphal growth.     

以thyA基因为选择压力非抗性质粒载体的构建

以干酷乳杆菌L.casei34103染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增胸苷酸合成酶（Thymidylatesynthase,thyA)基因,回收纯化,选择以红霉素抗性为选择压力的可以在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的质粒pW425e为基本质粒,以thyA基因取代红霉素基因,获得重组载体并鉴定,此重组载体可以对thyA基因缺陷的大肠杆菌E.coli X51和嗜酸乳杆菌DOMLaS 107进行功能弥补,进而构建了以thyA基因为地选择压力的非抗生素抗性穿梭表达载体,其大小为3716bp,并命名为pW425t。     

Carbon source dependent phosphorylation of the Gpr1 protein in the yeast Yarrowia lipolytica

The Gpr1 protein of the ascomycetous yeast Yarrowia lipolytica belongs to the poorly characterised Gpr1/Fun34/YaaH protein family whose members have been only found in prokaryotes and lower eukaryotes so far. Gpr1p seems to be involved in acetic acid adaptation at low pH values. Here we show that Gpr1p is subjected to phosphorylation in dependence on the carbon source. Exhaustion of the carbon source resulted in a complete dephosphorylation of Gpr1p, whereas addition of a new carbon source caused the phosphorylation of Gpr1p. Almost all Gpr1p molecules became phosphorylated after addition of acetate, while other carbon sources only triggered the phosphorylation of about half of the Gpr1p molecules. Phosphorylation was found to occur at serine-37. In spite of the clear effect of acetate/acetic acid on the level of phosphorylation of Gpr1p, no correlation of phosphorylation/dephosphorylation and acetic acid hypersensitivity, caused by mutations within Gpr1p, was detected.     

细菌荧光酶报告基因载体构建及在Hela细胞中的表达

采用ＰＣＲ点突变技术,构建含有细菌荧光酶融合ｌｕｘＡＢ报告基因的重组哺乳动物载体ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ,脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染和Ｇ４１８抗性筛选稳定转染的Ｈｅｌａ细胞。ＰＣＲ和酶切电泳证明构建的正确性;经稳定转染ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ的Ｈｅｌａ细胞,用发光仪可测得较强的发光强度（最大值为４．１２ｍＶ／４０μｇ细胞总蛋白粗提物）。而亲本及ｐｃＤＮＡ３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞则在本底值范围,ｐｃＤＮＡ３－ｌｕｘＡＢ稳定转染与亲本及ｐｃＤＮＡ３稳定转染的Ｈｅｌａ细胞在细胞形态和培养条件等方面无明显差异。本工作为细菌荧光酶作为报告基因在肿瘤细胞中的表达和应用建立了基础。     

用电击孔法转染人红细胞生成素基因

用电击孔(electroporation)转染方法已成功地使化学合成的红细胞生成素(EPO)基因在猿猴肾细胞(COS-7)中表达。对转染条件、表达质粒(pSVL-EPO)DNA含量及转染后不同时间表达产率的观察和研究表明:电击孔缓冲液及相应电压的选择与表达产率有关,且表达质粒DNA量在50～100μg,转染细胞存活率在50％左右时,表达效果好。在转染后24h,便可在细胞上清液中测到EPO活性,48～72h达高峰,EPO活性可达9.7U/ml。