白喉毒素A链基因在植物中的表达能抑制蛋白质合成

利用原生质体瞬间表达系统证实,即使用大量蓖麻毒素Ａ链基因ＤＮＡ导入诸葛菜原生质体,基蛋白质合成仍不被抑制。但是诸葛菜和灰叶烟草原生质体的蛋白质合成却容易被表达的白喉毒素Ａ链所抑制。     

人胰岛素A、B链基因的合成、克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据人胰岛素A、B链的多肽顺序,设计并用一种简便快速的多肽基因合成了A、B链基因。合成的A 链和B 链基因分别克隆到pWR590质粒上,构建了表达型质粒pWR590-HIA和pWR 590-HIB,它们能够表达由β-半乳糖苷酶N-端约590个氨基酸残基与A 链或B 链组成的融合蛋白(两者之间由Met 连接)。A 链或B 链融合蛋白经BrCN 降解,磺化及分离纯化等步骤,得到了磺化A、B 链。磺化A、B链体外重组得到人胰岛素。     

人胰岛素A,B链基因的合成,克隆及其在大肠杆菌中的表达

Human insulin A and B chain genes were designed and synthesized by using a rapid and simple method. The synthesized A and B chain genes were cloned separately. The expression (plasmids) pWR 590-HIA and pWR 590-HIB were constructed, and the two plasmids can direct the synthesis of the approximately 590 amino acid-long truncated beta-galactosidases fused to human insulin A or B chains. The fused A or B chain proteins were isolated from the fermented cells and cleaved with BrCN. The resulting mixtures were sulfonated and the sulfonated A and B chains were purified. Human insulin was obtained by using an A and B chain combination method.     

蜘蛛杀虫肽基因的合成及其在植物中表达质粒的构建

近年来用生物制剂防治害虫,虽然可以避免环境污染,但效果往往不稳定,而用基因工程方法,将抗虫基因导入植物的基因组中,让植物自身产生抗虫物质,将是一种理想的途径［１,２］。抗虫的植物基因工程主要是利用苏云金杆菌的内毒素蛋白,转化此基因的烟草和番茄显示了对虫的抗性［３—６］。澳大利亚Ｄｅａｋｉｎ大学从一种蜘蛛毒液中分离纯化到一种只有３７个氨基酸的小肽,体外实验发现其能杀死多种对农业生产有害的昆虫,但对哺乳动物没有毒害作用［７］。我们根据此肽的氨基酸序列,采用植物偏爱的密码子,人工合成并克隆了此肽的基因…     

外源GUS基因在PEG介导的花椰菜原生质体中的瞬间表达

为了将外源基因导入花椰菜原生质体获得转基因植株,本文研究了ＰＥＧ介导的外源基因在花椰菜下胚轴原生质体中的瞬间表达。（１）２０％ＰＥＧ将质粒ｐＢＩ２２１导入原生质体后ＧＵＳ表达比１３％ＰＥＧ导入的高,但易造成原生质体损伤。（２）热激处理增强表达,但在随后的培养过程中易造成原生质体降解。（３）原生质体状况对表达有重要影响,５ｄ龄下胚轴原生质体比８ｄ龄的表达强。（４）不同质粒及启动子表达强度不同。质粒ｐＫＩＷＩ１０１比ｐＢＩ２２１表达强３倍左右。     

叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片生长过程中的表达研究

叶绿体是绿色植物把光能转化为化学能的重要细胞器.目前,多种植物的叶绿体基因组序列已经获得,对叶绿体内发生的各种生物学过程人们也已经有相当深入的了解,但对叶绿体基因编码蛋白质的表达还所知甚少.用蛋白质印迹实验系统地检测了15个叶绿体基因编码蛋白质在水稻叶片不同生长时期的表达.其中7个与光合作用相关蛋白质的表达具有相似的模式,其表达量随叶片生长而增加,一般在孕穗期、开花期达到最高峰,在成熟期叶片下降,这种模式与水稻生长对光合作用的需求有明显相关性.4个与DNA复制相关的RNA聚合酶在苗期叶片中表达量达到最高,说明这些聚合酶在较早时期发挥作用.4个NADH脱氢酶蛋白质的表达呈2种不同的模式,其中亚基2和4在种子萌发后的早期叶片中就达到最高峰,亚基5和7的最高峰出现在中后期,反映了它们之间功能上的不同.实验结果直观且相对定量地揭示了叶绿体编码蛋白质的表达与叶片生长之间的关联关系,为深入了解其功能提供了重要的线索.     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

甘薯叶绿体表达载体构建及其融合基因在叶绿体中的瞬间表达

利用叶绿体基因组进化中高度保守的特点,根据烟草叶绿体基因组全序列设计引物,从甘薯(Ipomoea batatas)叶绿体基因组中克隆了2个相邻的功能基因rbcL(GenBank登录号为AY942199)和accD(GenBank登录号为AY942200),并以此作为定点整合外源基因的同源重组片段.以来自叶绿体基因组的强启动子Prrn和RpsbA-pro分别驱动选择标记基因aadA及phaC-gfp融合基因,构建成表达盒prrn-aadA-TpsbA-ter与RpsbA-pro-phaC-gfp-RpsbA-ter,然后将这2个表达盒串联在一起克隆进甘薯叶绿体同源片段中,获得甘薯叶绿体定点整合表达载体pSC-GFP.酶切分析证明,所构建的载体符合预期设计;采用该载体对甘薯叶片进行基因枪转化,结果显示,phaC-gfp融合基因可在叶绿体特异启动子和终止子的调控下在甘薯幼嫩叶片中瞬间表达,证明构建的载体pSC-GFP可用于甘薯叶绿体转化.     

人蛋白质二硫键异构酶Cdna基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总RNA,在总RNA中提取mRNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物．进行PCR合成人蛋白质二硫键异构酶(Proteim disulfide isomerase,PDI)cDNA基因,将所得cDNA克隆到质粒pUCl8上,转化大肠杆菌DH5a细胞,进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体pBV220上,在大肠杆菌细胞中表达,产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离,产物的纯度与活性分别为90％、1100u／g。     

新构建的含DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体对人乳腺癌细胞的特异性杀伤作用

目的研究新构建的含人乳腺癌DF3启动子和白喉毒素A片段的重组表达载体PGL3-DF3-DTA对人乳腺癌细胞的影响。方法构建重组表达载体PGL3-DF3-DTA,并用其转染DF3阳性和阴性的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231。通过MTT法测定PGL3-DF3-DTA在体外对乳腺癌细胞生长的影响,建立裸鼠动物模型观察PGL3-DF3-DTA在体内对乳腺癌细胞的杀伤效应。结果成功构建出重组表达载体PGL3-DF3-DTA并建立了人乳腺癌裸鼠动物模型,经重组表达载体PGL3-DF3-DTA作用后的DF3阳性人乳腺癌细胞出现明显的凋亡现象,Ki-67、bcl-2基因表达水平降低,bax基因表达水平升高。结论重组表达载体PGL3-DF3-DTA能对DF3阳性的乳腺癌细胞产生特异性杀伤作用。     

三个与agropine合成相关的基因在大肠杆菌微细胞中的表达

pTiAch 5 TR区与在植物中积累agropine相关的三个基因片段已导入pINIIA或pACYC184,在大肠杆菌微细胞中表达出杂合蛋白。三个基因片段的pINIIA重组质粒的表达得到稳定蛋白、不稳定蛋白和在两个相表达出相似蛋白的三种结果。基因2'HindⅢ片段上的UGAA序列是在两个相表达相似蛋白的原因。从产生的杂合蛋白分子量和读码方式看,pTiAch 5中基因2'和基因1'的结构与pTi 15955近似,但由基因0'片段产生的杂合蛋白分子量比根据pTi15955 DNA序列数据推测的稍大。从表达强度和微细胞操作看,这个系统还不适应从大肠杆菌中方便地纯化杂合蛋白的需要。     

用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株

通过PEG处理把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体。转化介质中二价阳离子的种类和浓度、携带DNA及PEG溶液的pH值都会影响基因导入效率。以潮霉素抗性和卡那霉素抗性作标记,均成功地筛选到了抗性愈伤组织。相对转化频率分别为1.3%和0.2%。前者明显高于后者。把抗性愈伤组织转到分化培养基上,分化出芽。诱导生根后移栽到土壤中,生长状况良好。酶活性测定和Southern blotting分析表明外源基因已插入到植物细胞基因组中。该遗传转化系统存在的主要问题是抗性愈伤组织分化频率较低。本文对其原因作了初步分析。     

细胞分裂素生物合成基因在调节一组烟草病理相关蛋白基因表达中的作用

对一组病理相关蛋白基因在烟草 ( N icotiana tabacum cv. Wisconsin 38)中的表达情况进行了研究 ,包括 :碱性几丁质酶、β- 1 ,3-葡萄糖苷酶、渗透蛋白及伸展蛋白。RNA杂交实验表明在正常烟草植株中上述 4个基因具有发育和器官专一性的表达。在含有细胞分裂素生物合成基因的转基因烟草丛生芽中 ,这 4个基因的表达受过量合成的内源细胞分裂素和载体效应的共同调节 ,细胞分裂素降低这些基因的表达 ,而载体效应则促进它们的表达。热激处理也明显降低这 4种基因的表达水平。上述结果表明这些病理相关蛋白基因具有复杂的调控系统