转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:转铁蛋白受体特异性富含于血脑屏障和肿瘤细胞的表面,是当前中枢神经系统疾病和肿瘤治疗中定向转运的重要靶标。拟获得在大肠杆菌中能高效可溶表达的转铁蛋白受体单链抗体与链亲和素(SA)的重组融合蛋白。方法:根据GenBank数据库报道的SA的核苷酸序列分段合成基因,连接后经PCR获得完整的基因片段,插入pGEM-T载体中测序。将序列正确的SA基因与大鼠转铁蛋白受体单链抗体基因ox26-scFv分别插入原核表达载体pTIG-Trx中,构建重组表达克隆pTIG-Trx/scFv-SA,并在大肠杆菌中诱导表达。ELISA检测融合蛋白的生物学活性。结果:对pGEM-T/SA克隆的测序结果显示,合成的SA基因与文献报道相符。重组融合蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,约占菌体上清总蛋白量的30%;ELISA结果表明该融合蛋白具备与转铁蛋白受体和生物素的结合的双重活性。结论:有活性的重组融合蛋白的获得为构建一个通用性的以转铁蛋白受体介导的血脑屏障和肿瘤转运靶向载体打下了基础。     

乙内酰脲水解酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

节杆菌BT801的乙内酰脲酶系能够水解5-苄基乙内酰脲生成L-苯丙氨酸,其中乙内酰脲水解酶负责乙内酰脲的水解开环。乙内酰脲水解酶的表达对于乙内酰脲酶的催化机制研究及氨基酸的生物不对称合成都具有重要意义。通过PCR技术扩增得到乙内酰脲水解酶基因(hyuH),置于表达载体pT221的,17启动子下游,将构建的重组质粒引入大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析在相对分子量50kD处有一较强的表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40％,主要以可溶性形式存在,活性分析表明表达产物具有天然的酶活性。     

在大肠杆菌中表达有活性的人STK11蛋白

STK11蛋白(serine/threonine kinase11)是近年来发现的具有多种重要功能的蛋白,可参与调控细胞周期、p53介导的细胞凋亡、ras诱导的细胞转化、细胞极化等多种生物学过程。利用大肠杆菌高效表达有活性的人STK11蛋白,可为其结构和功能的深入研究打下良好基础。利用本室克隆的人STK11 cDNA和原核表达载体pET-44a( )构建带有Nus融合标签的诱导型表达载体pET-Nus-STK11,在不同的大肠杆菌宿主中诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明,在BL21(DE3)宿主中表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的8.9%;在Rosetta-gami(DE3)pLysS宿主中主要表达为可溶性蛋白,占菌体总蛋白的16.7%。而经纯化和包涵体蛋白复性处理后,以Chariot介导重组融合蛋白进入人肝癌细胞SMMC-7721检测其对细胞生长和细胞周期的影响。与对照组相比,BL21(DE3)中表达的Nus-STK11蛋白几乎无抑制活性;而Rosetta-gami(DE3)pLysS中表达的Nus-STK11蛋白可以显著抑制SMMC-7721细胞的生长,抑制率达47.05%,并导致细胞周期的G0/G1期阻滞,证实表达的重组融合蛋白具有明显的生物学活性。上述结果为在大肠杆菌中成功表达有活性的重组STK11蛋白的首次报道。     

Angioarrestin(hARPl)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定

 Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestin C端 hFD cDNA 和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒 pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,经0.3 mmol/LIPTG 在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE 检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET 22b（+）表达系统获得的 hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明：通过基因重组可获得angioarrestin C端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.     

Expression of human cardiac-specific homeobox protein in Escherichia coli

Human cardiac-specific homeobox protein cDNA (hCsx) was cloned into expression plasmid pET32a and fused with Escherichia coli thioredoxin (Trx). The Trx-Csx fusion protein was under the control of bacteriophage T7 promoter. When expressed in E. coli BL21(DE3), about half of the recombinant Trx-Csx products existed in the form of insoluble inclusion bodies. When coexpressed with human protein disulfide isomerase, more than 90% of Trx-Csx products accumulated in the soluble form in the cell lysate. The recombinant Csx fusion protein was purified by one-step metal-chelating affinity chromatography.     

人Src蛋白N端区段的表达、纯化和体外豆蔻酰化底物活性

利用RT PCR技术 ,从来源于人结肠癌Caco 2细胞总RNA中 ,扩增得到编码人Src蛋白N端 147氨基酸的DNA序列片段。进而构建T7启动子控制下的C端His tag融合的表达质粒pMF SrcHT ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3)。通过SDS PAGE等分析结果显示 ,在 37°C培养条件下经IPTG诱导 ,C端His tag融合的人Src蛋白N端区段 (命名为SrcHT ,2 1kD)得到高效表达 ,并且主要以可溶性形式存在。进一步利用Ni IDA亲和层析分离 ,从表达菌裂解上清液中一步纯化获得重组蛋白SrcHT ,SDS PAGE分析纯度达 95 %以上。在此基础上 ,以 [3H]豆蔻酰 CoA为同位素标记底物进行SrcHT的体外NMT豆蔻酰化反应测定。SDS PAGE分离和放射自显影分析结果表明 ,SrcHT蛋白可被NMT有效豆蔻酰化而具有NMT的底物活性。这些为深入详细研究Src蛋白豆蔻酰化作用和构建以Src蛋白豆蔻酰化为靶标的分子筛药体系等打下了重要基础。     

酮古龙酸菌山梨酮脱氢酶的原核表达及活性鉴定

目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨酮脱氢酶基因sndh2,在大肠杆菌中进行表达,并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sndh2基因,连接到pET22b表达载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达;对菌体裂解液进行SDS-PAGE分析;以D-木糖为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色及DCIP检测法鉴定表达产物的脱氢酶活性。结果:扩增得到1290 bp的山梨酮脱氢酶基因;构建了表达质粒pET22b-sndh2,SDS-PAGE结果显示获得相对分子质量为43.1×103的可溶性表达产物;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上出现的蓝黑色条带及DCIP检测液颜色的变化说明表达产物在以D-木糖为底物时表现出脱氢酶活性。结论:在大肠杆菌中表达的山梨酮脱氢酶具有生物活性。     

高活性重组hG-CSF的制备

我们构建了新的硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）融合表达载体ｐＥＴＴｒｘＬ和ｐＥＴＴｒｘ－ＨｉｓＬ,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的４１％以上。所表达的ｈＧ－ＣＳＦ－硫氧还蛋白融合蛋白可通过Ｃｕ２＋－ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有ｈＧ－ＣＳＦ特异的生物活性,其比活性达到０．５－１．３３×１０７ｕ／ｍｇ融合蛋白。这样表达的ｈＧ－ＣＳＦ融合蛋白能被ＩｇＡ蛋白酶特异地切割,将ｈＧ－ＣＳＦ从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组ｈＧ－ＣＳＦ 。     

枯草杆菌谷氨酰胺转胺酶的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

利用PCR技术 ,从枯草杆菌DB40 3染色体上扩增出谷氨酰胺转胺酶基因 ,将其克隆到大肠杆菌载体pET32a( + )中 ,成功构建谷氨酰胺转胺酶表达载体pET32-BTGase ,并转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。重组克隆在IPTG诱导下 ,表达出硫氧还蛋白 谷氨酰胺转胺酶 (Trx-BTGase)融合蛋白 ,表达量占细菌总蛋白量的 2 6%。利用金属螯合层析纯化菌体裂解上清中表达的融合蛋白 ,纯度超过 80 %,再通过分子筛层析进一步纯化得到融合蛋白纯品。酶活性分析表明表达的Trx-BTGase融合蛋白具有交联蛋白的活性 ,并发现Trx-BTGase融合蛋白和经凝血酶酶切后得到的BTGase单体都能催化牛血清白蛋白的聚合反应     

中国林蛙核糖核酸酶Rdrlec新基因的原核可溶表达

来源于蛙属的核糖核酸酶由于具有显著的抗肿瘤活性而备受关注,Rdrlec是从中国林蛙基因组中克隆得到的核糖核酸酶新基因。获得大量高纯度野生型重组蛋白是研究其功能的基础。按照大肠杆菌偏好的密码子人工合成Rdrlec基因,通过EcoR I和Hind III位点插入到表达载体pET-32a(+)中构建pET32-Rdrlec重组表达质粒,转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,0.4 mmol/L IPTG 30℃诱导6 h后,融合蛋白主要以可溶形式表达,经过Ni-NTA亲和纯化和Sephadex G75层析纯化,得到电泳纯融合蛋白。肠激酶切割后得到Rdrlec野生型重组蛋白,具有降解RNA的酶活性,证明分子的空间结构已经正确形成。Rdrlec野生型重组蛋白表达成功,为后续蛋白结构与功能的研究以及进一步的开发应用提供了原料。     

Antimicrobial action of histone H2B in Escherichia coli: evidence for membrane translocation and DNA-binding of a histone H2B fragment after proteolytic cleavage by outer membrane proteinase T

Previous studies have led to the isolation of histone H2B with antibacterial properties from an extract of the skin of the Schlegel's green tree frog Rhacophorus schlegelii and it is now demonstrated that the intact peptide is released into norepinephrine-stimulated skin secretions. In order to investigate the mechanism of action of this peptide, a maltose-binding protein (MBP)-fused histone H2B (MBP-H2B) conjugate was prepared and subjected to antimicrobial assay. The fusion protein showed bacteriostatic activity against Escherichia coli strain JCM5491 with a minimum inhibitory concentration of 11 microM. The lysate prepared from JCM5491 cells was capable of fragmenting MBP-H2B within the histone H2B region, but the lysate from the outer membrane proteinase T (OmpT) gene-deleted BL21(DE3) cells was not. FITC-labeled MBP-H2B (FITC-MBP-H2B) penetrated into the bacterial cell membrane of JCM5491 and ompT-transformed BL21(DE3) cells, but not into ompT-deleted BL21(DE3) cells. Gel retardation assay using MBP-H2B-deletion mutants indicated that MBP-H2B bound to DNA at a site within the N-terminal region of histone H2B. Consequently, it is proposed that the antimicrobial action of histone H2B involves, at least in part, penetration of an OmpT-produced N-terminal histone H2B fragment into the bacterial cell membrane with subsequent inhibition of cell functions.     

应用分子伴侣共表达系统表达pfu基因及酶活性测定

将通过In-fution方法构建的pET32a-pfu质粒与可以促进可溶性表达的HG-PGR07质粒一起转入大肠杆菌B121（DE3）共表达,以pET32a-pfu单独在B121（DE3）中表达作为对照。用热变性和（NH4）2SO4沉淀去除部分杂蛋白,再经Ni—NAT亲和层析柱纯化分离尼血蛋白,SDS-PAGE检测结果表明目的蛋白大小约为90kD,与预计的分子量大小一致。最后对其酶活性测定结果表明分子伴侣能够促进pfu基因表达,并能够提高酶活性。     

SUMO蛋白酶活性片段的表达、纯化及活性测定

利用PCR技术人工合成编码酿酒酵母泛素样特异性蛋白酶1 (Ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段Ulp1p,并连接到大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-Ulp1p。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。经IPTG诱导4h后, SDS-PAGE结果显示,Ulp1p为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的50.8%。通过Ni-NTA凝胶亲和层析和G-25凝胶层析联用可以获得纯度大于95%的Ulp1p。Western-blotting分析表明,Ulp1p能与6xHis抗体产生免疫反应。以重组蛋白SUMO-hEGF(人表皮生长因子)和GST-SUMO-MT(金属硫蛋白)为底物进行酶切分析,结果显示,Ulp1p能特异性水解这两种SUMO融合蛋白,其比活为1.386 x104U/mg。     

Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli

The complete gene xyn// that encodes endo-1,4-beta-xylanase secreted by Aspergillus usamii E001 was cloned and sequenced. The coding region of the gene is separated by only one intron. It encodes 184 amino acid residues of a protein with a calculated molecular weight of 19.8kDa plus a signal peptide of 27 amino acids. The amino acid sequence of the xyn// gene has higher similarity with those of family 11 of glycosyl hydrolases reported from other microorganisms. The mature peptide encoding cDNA was subcloned into pET-28a(+) expression vector. The recombinant plasmid was expressed in Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, and xylanase activity was measured. The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE and a new specific band with molecular weight of about 20kDa was found when induced by IPTG. Enzyme activity assay verified the recombinant protein as a xylanase. A maximum activity of 49.6Umg(-1) was obtained from cellular extract of E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL harboring pET-28a-xyn//. The xylanase had optimal activity at pH 4.6 and 50 degrees C. This is the first report on the cloning of a xylanase gene from A. usamii.     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的原核表达及活性检测

目的：克隆酮古龙酸菌Y25的山梨醇脱氢酶基因sldh,在大肠杆菌中进行表达并检测表达产物的活性。方法：以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sldh基因,连接到表达载体pTIG,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达;取表达菌体、菌体裂解上清和沉淀进行SDS-PAGE分析;以山梨醇为底物,通过活性电泳、体外转化及休止细胞转化进行sldh基因表达产物的活性检测。结果：扩增得到1740 bp的山梨醇脱氢酶基因,构建了表达质粒pTIG-sldh并在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示表达产物为可溶性形式,相对分子质量约58×10^3;活性电泳结果说明表达产物在以山梨醇为底物时表现出脱氢酶活性,而经体外转化和休止细胞转化后薄层层析检测出转化产物山梨糖的存在。结论：在大肠杆菌中实现了酮古龙酸菌山梨醇脱氢酶的可溶性表达,且表达的重组脱氢酶能将山梨醇脱氢生成山梨糖。     

甘蔗花叶病毒CP基因的高效表达和抗血清制备

将甘蔗花叶病毒的CP基因克隆到表达载体pET22b( ),并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,表达蛋白约占总蛋白的15％。用此蛋白制备了效价高专化性强的抗体。此方法可以解决制备马铃薯Y病毒属病毒的血清时遇到的病毒提纯产量低和寄主蛋白影响等问题。     

一种新型融合蛋白(RGD)3/tTF的基因表达与活性分析

为了发展一种新型的融合蛋白(RGD)3/tTF用于肿瘤血管的选择性栓塞治疗,利用PCR技术重组(RGD)3/tTF融合基因,克隆于pET22b( )载体,表达于E.coliBL21(DE3)。用镍柱纯化融合蛋白。凝血实验与FⅩ活化实验检测融合蛋白tTF组分的活性。间接ELISA分析(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力。pET22b( )/(RGD)3/tTF重组质粒成功获得并表达于E.coliBL21(DE3)。纯化蛋白(RGD)3/tTF能有效诱发血液凝固,活化FⅩ。(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力比RGD/tTF提高了32%。新型融合蛋白(RGD)3/tTF已在E.coli系统成功表达,表达蛋白保持tTF的活性并显示比RGD/tTF更高的与αvβ3的结合能力。     

鲎血细胞中脂多糖结合蛋白TALF在大肠杆菌中的表达研究

TALF(Tachyleus antilipoposaccharide factor)对细菌内毒素（LPS）的核心部分有抑制作用。研究TALF cDNA基因在大肠杆菌中的表达,首先将TALF cDNA基因分别插入大肠杆菌表达载体pGEX-4T-2、pET22b、pET28a中,构建重组表达质粒,转化于大肠杆菌BL21(DE3)。结果表明克隆于pET22b、pET28a中的TALF cDNA基因没有表达,而融合了GST的TALF基因（GST-TALF）能够在大肠杆菌中表达,并形成包涵体。从1L培养基中可获得4mg纯度为91%的GST-TALF融合蛋白。经复性和纯化后的融合蛋白GST-TALF几乎检测不到抑菌活性及LPS中和活性,但该融合蛋白经凝血酶消化后表现出明显的体外抑菌活性及LPS中和活性。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。