从兰州急性腹泻儿童中检出人博卡病毒4型

为了解兰州地区病毒性腹泻患儿中人博卡病毒4(HBoV4)的流行情况,收集兰州大学第一医院2012年7月至2013年6月5岁以下腹泻患儿的粪便标本331份,采用巢式PCR方法检测HBoV。将HBoV阳性序列与GenBank中相关序列进行比较分析,发现1例罕见HBoV4。该株与泰国株(GenBank登录号:JQ267789)核苷酸和氨基酸的同源性为98.9%、98.7%,与美国株(GenBank登录号:GQ506568)核苷酸和氨基酸的同源性为97.6%、97.4%,为典型的HBoV4,是我国首次在腹泻患儿粪便中发现。由进化树及同源性推测HBoV4可能存在两种不同的亚型。上述结果表明,我国首次在腹泻患儿粪便中检出HBoV4,且属于HBoV4两种可能亚型中的一种亚型。     

兰州地区腹泻患儿中人博卡病毒1～4型流行病学研究

了解兰州地区病毒性腹泻患儿中人博卡病毒1~4型(HBoV1~4型)的流行情况及临床特点,并探讨HBoV与急性胃肠炎的疾病相关性。收集兰州大学第一医院2012年7月至2013年6月5岁以下腹泻患儿的粪便标本331份,采用PCR方法检测人博卡病毒,同时检测常见的肠道病毒。331份标本中共检出博卡阳性标本49例(14.80%),其中HBoV1~4型分别检测出26例、15例、7例和1例。分析其流行规律发现HBoV相关的腹泻全年散发,无明显季节分布。HBoV感染的患儿年龄为11.04±6.92月龄,高发年龄是7~12月龄。2岁以下患儿占HBoV阳性患儿总数的93.88%。HBoV与其他病毒混合感染率为71.3%,以混合轮状病毒为主。HBoV感染对腹泻患儿的发热和呕吐发生率无明显影响。检测出一例罕见的HBoV4病毒LZFB086,与泰国(序列号JQ267789)参考株的同源性为99.0%。未检测出HBoV2B型。从研究结果得出我国兰州地区人博卡病毒以HBoVl为主,在我国首次发现HBoV4病毒。HBoV1~4与其他病毒的混合感染率高,主要是混合轮状病毒。HBoV可能不是导致急性胃肠炎的致病病原。     

人博卡病毒2基因组扩增及序列分析

为获得人博卡病毒2(Human bocavirus 2,HBoV2)基因组序列,以2010年HBoV2单阳粪便标本为材料,PCR方法扩增HBoV2基因组不同区域,经序列拼接后得到5444bp的全基因组序列(HBoV2-NC)。系统进化分析显示,HBoV2-NC与兰州株HBoV2亲缘关系最近;DINAMelt末端回文结构预测证实,HBoV2-NC 5′末端存在反向互补序列,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;接头法PCR扩增得到HBoV2-NC部分末端侧翼序列。     

儿童急性呼吸道博卡病毒感染

了解博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况。采用PCR扩增的方法对2005年10月~2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPA)进行了HBoV基因检测。将PCR阳性产物进行TA克隆,测序,并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析。72份标本中共检测到6份HBoV阳性扩增产物,阳性率为8.3%(6/72),该6例HBoV阳性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状。由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原,且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性。     

人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

人博卡病毒1 (human bocaparvovirus 1, HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2−5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。     

人博卡病毒I型的研究进展

人博卡病毒1型(HBoV1)为引发呼吸道感染一种新发病毒,具有典型的细小病毒科病毒基因组特征,3个开放阅读框分别编码非结构蛋白NS1、NP1和结构蛋白VP1和VP2;HBoV1进行滚环复制时存在复制环形附加体,附加体的发现为扩增HBoV1全基因组和构建感染性克隆拯救病毒提供可能,同时HBoV1与HBoV2-4间存在着重组关系;HBoV1的体外增殖随着三维立体细胞培养而成为现实,为HBoV1的致病机制研究提供有力平台。本文重点对HBoV1的分子生物学特征、疾病相关性、体外增殖培养、HBoV1的诊断和治疗进行阐述。     

人博卡病毒2型VP1U突变对sPLA2活性的影响

对HBoV2 VP1U蛋白进行原核表达并检测其sPLA_2活性,对其关键氨基酸进行突变,检测突变对sPLA_2活性的影响。构建重组质粒pMD18T-VP1U,选取VP1U蛋白4个关键氨基酸为突变点,分别进行原核表达,蛋白纯化后用sPLA_2试剂盒检测sPLA_2活性,对比突变前后VP1U蛋白sPLA_2活性有无变化。野生型HBoV2VP1U蛋白的sPLA_2活性为0.243μmol/min/mL,具有sPLA_2活性;突变体L19P、P21R、D42H及Y45N蛋白的sPLA_2活性分别为野生型蛋白的1.2%、1.2%、0.82%、0.41%。野生型HBoV2VP1U蛋白具有sPLA_2活性,突变体蛋白均几乎完全丧失了sPLA_2活性,提示19、21、42、45位4个氨基酸是维持sPLA_2活性的关键氨基酸。该研究为靶向抗病毒药物的研究提供了理论基础。     

猪博卡病毒的研究进展

猪博卡病毒是细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属的新成员,2009年发现于患仔猪断奶后多系统衰竭综合征的瑞典猪群中。目前,猪博卡病毒作为新发现的病原,已是世界各国科研人员的研究热点。本文结合已发表的文献,对猪博卡病毒的发现、分类、基因组结构与复制、流行病学、与疾病的相关性、培养与检测等方面进行了阐述,为广大科研人员对猪博卡病毒的研究提供一定的理论依据。     

可调控表达人博卡病毒1型非结构蛋白NS1稳定细胞系的建立及其反式转录激活作用初探

人博卡病毒1型(Human bocavirus 1,HBoV1)非结构蛋白NS1是多功能蛋白,对病毒复制有重要作用,同时可诱导宿主细胞凋亡。在研究NS1蛋白功能时,降低NS1蛋白对宿主细胞的毒性作用是急需解决的问题。基于此,文中建立了可调控表达HBoV1非结构蛋白NS1的稳定细胞系。构建NS1重组慢病毒质粒(含可调控启动子),应用转染试剂将NS1重组慢病毒质粒转染至HEK293T细胞。通过嘌呤霉素筛选抗性细胞、多西环素诱导NS1表达,建立可稳定表达NS1-100、NS1-70蛋白的HEK 293T细胞系,利用荧光标记蛋白和Western blotting检测,确定NS1蛋白的表达。并在稳定表达NS1细胞系中转染HBoV1启动子-荧光素酶基因的质粒,分析NS1的反式转录激活活性。结果表明NS1蛋白可在建立的细胞系中稳定表达,且稳定表达NS1蛋白对HBoV1启动子有较强的激活活性,为进一步研究非结构蛋白NS1的功能及人博卡病毒致病机理奠定了良好的基础。     

夏季小儿急性肠炎时肠道双歧杆菌的动态变化

本文测定了30例夏季小儿急性细菌性腹泻患儿发病早期粪便中双歧杆菌的数量,并与15例健康儿作了对照。结果提示急性细菌性腹泻时双歧杆菌数量明显低于健康儿。从上述肠炎患儿中随机选取10例,分别在发病早期、好转期、痊愈时及痊愈后一周做了双歧杆菌的动态定量分析,发现2例在病程中逐渐减少,8例在粪便稀释10倍时亦未检出,10例患儿在愈后一周时双歧杆菌均低于健康小儿。对双歧杆菌的生理作用进行了讨论。     

长春市儿童医院1998～2001年婴幼儿杯状病毒腹泻流行病学研究

人类杯状病毒(human calicivirus,HuCV)是引起儿童和成人非菌性胃肠炎的主要病原之一.为了掌握HuCV在我国的流行情况,1998年7月至2001年6月,从长春市儿童医院2343例5岁以下腹泻患儿中共收集粪便标本1264份,其中1056份来自2135例住院患儿.对轮状病毒检测为阴性的588份标本,经多价酶免疫试验(EIA)和两组引物反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HuCV,202份为阳性,其中住院患儿标本178份,HuCV检出率为16.9%.HuCV腹泻以2岁以下儿童为主(占96%),流行高峰季节为11月至次年3月.选择17株HuCV进行分子鉴定,15株属GⅡ-4群,1株属GⅡ-3群,另1株属GⅠ-2群,表明GⅡ-4群HuCV是我国流行的优势株.根据HuCV住院患儿的监测资料初步估计,HuCV腹泻住院率约为0.5‰～2.4‰.讨论了长春地区HuCV的流行趋势和疾病负担.以上结果为我国HuCV腹泻的预防和控制提供了科学依据.     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

口服补液盐治疗儿童急性腹泻轻中度脱水的疗效研究

目的:观察口服补液盐治疗儿童急性腹泻轻中度脱水的临床疗效。方法:选取我院儿科收治的63例急性腹泻伴轻中度脱水症状患儿,采取随机数表法分为两组,其中对照组32例患儿予标准口服补液盐,而治疗组31例患儿予补液盐溶液。对比治疗前后两组患儿血浆内Na+、K+、Cl-离子水平,临床症状恢复时间及改善情况。结果:治疗后,两组患儿的电解质水平均有所改善,治疗组患儿Na+、K+及Cl-水平均优于对照组,差异有统计学意义(P0.05);治疗组患儿口渴、头晕、乏力及腹痛症状的恢复时间均较对照组明显缩短,差异有统计学意义(P0.05)。治疗组临床总有效率明显优于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:口服补液盐能明显改善儿童急性腹泻而致的轻中度脱水症状,减少静脉输液对患儿造成的负面影响,值得在临床上进行推广。     

Detection of a Bocavirus Circular Genome in Fecal Specimens from Children with Acute Diarrhea in Beijing,China

To determine if human bocavirus 2 (HBoV2) has a circular genome similar to the head-to-tail sequence of HBoV1 and the episomal form of HBoV3, 15 HBoV2 positive samples identified from 553 stool specimens from children with acute diarrhea were tested for a head-to-tail sequence using TaqMan-based real-time PCR. A circular genome with a head-to-tail sequence was identified in one (BJQ435) out of 15 samples tested by nested PCR. The complete circular genome of HBoV2-C1 (BJQ435) was 5307 nt in length and was flanked with a 520 nt-long terminal non-coding region (NCR). The secondary structure of HBoV2 -C1 had some differences compared to HBoV3-E1 ({"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"JN086998","term_id":"340746301","term_text":"JN086998"}}JN086998). Our study indicates that the HBoV genome exists in the form of a head-to-tail monomer and provides more information for understanding the HBoV replication mechanism.     

双歧杆菌菌液保留灌肠治疗小儿腹泻初探

本文就婴儿双歧杆菌菌液保留灌肠对小儿腹泻的治疗作用进行了初步观察。结果发现,31例试验组患儿治疗后,其大便双歧杆菌活菌计数及革兰氏阳性菌比例均较治疗前和对照组明显升高。提示双歧杆菌菌液保留灌肠对小儿腹泻有治疗作用。     

人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

目的:克隆、表达、纯化人类博卡病毒(HBoV)非结构蛋白NS1,制备抗NS1多克隆抗体。方法:利用PCR扩增HBoV非结构蛋白NS1基因,将其克隆至pMAL-c2X表达载体上,重组质粒转化大肠杆菌DH10B,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经Amylose Resin亲和层析柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。用间接ELISA法检测抗体效价。结果:原核表达融合蛋白MBP-NS1,并获得了其多克隆抗体,抗体效价达到1∶32000。结论:在原核表达系统中表达、纯化了融合蛋白,制备抗NS1多克隆抗体,为进一步研究该病毒非结构蛋白基因的转录和翻译机制提供可靠的工具。     

成人和儿童急性早幼粒细胞白血病患者应用三氧化二砷的对比研究

目的:探讨持续慢点三氧化二砷(As2O3)治疗儿童和成人急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的疗效。方法:选取2007-2011年来我院就诊并采取持续慢点As2O3方式治疗的APL患者60例,其中儿童28例,成人32例。成人As2O3剂量为0.16 mg/kg,儿童为0.08 mg/kg,每分钟8滴,18-21 h完成,28天为一疗程。测量两组不同时间点的血总砷及血三价砷浓度,并记录治疗过程中高白细胞血症的发生率及高白细胞血症持续时间。结果:儿童中高白细胞血症的发生率为60.71%(17/28),明显高于成人的34.38%(11/32),差异有统计学意义(P0.05)。成人高白细胞血症平均持续时间为7.4天(6-10天),明显高于儿童的5.53天(4-8天),差异有统计学意义(P0.01)。成人不同时间点血总砷浓度高于儿童(P0.01),同一时间点血三价砷浓度高于儿童;随着用药时间延长,成人和儿童血总砷浓度和三价砷浓度增加,差异有统计学意义(均P0.01),于用药第14天达稳态。结论:儿童高白细胞血症发生率高于成人,持续时间短,血总砷及三价砷浓度水平低于成人。     

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。