细胞培养上新城疫病毒HN基因在抗体免疫选择压作用下的抗原表位变异

本实验研究了抗体免疫选择压对新城疫病毒（NDV）HN基因和F基因变异的影响。将NDV野毒株TZ060107分别接种到含有抗NDV的单因子血清（A组）与不含抗体的（B组）鸡胚成纤维细胞中连续传代,每组设3个独立的传代系列。分别对第10,20,30,40,50代病毒的HN和F基因进行扩增克隆测序。序列比较结果显示,有抗体A组HN基因发生突变的位点数明显多于无抗体B组,且非同义突变（NS）与同义突变（S）比值NS／S为6,明显高于无抗体B组NS／S的3.4。在有抗体A组有5个碱基位点发生稳定的非同义突变,而且其中3个（aa#353,521和568）与已知的抗原表位密切相关。F基因在有抗体A组也出现2个稳定的非同义突变,无抗体B组没有产生稳定变异。但不论在有抗体A组还是无抗体B组,F基因变异的NS／S比均小于2.5。本研究表明,抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异,但对F基因变异的影响小于HN基因。     

新城疫病毒HN和F基因遗传变异相关性的研究

选取国内1999~2005年发生的NDV毒株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆测序,结合在GenBank中发表的具有F和HN基因的NDV序列,利用DNAStar软件,对其不同毒株的F或HN基因片段和全长、F和HN基因全长分别进行遗传变异的研究,利用统计学软件SPSS8.0进行同源性相关分析。结果表明:不同NDV毒株F或HN基因片段与其全长之间,核甘酸r≥0.973,氨基酸:0.911≤r≤0.968,遗传变异高度相关,但F与HN基因全长之间核甘酸的遗传变异呈现弱相关(r=0.312)。国内NDV野毒株之间HN核甘酸高度同源(同源率97%以上),而与La Sota同源率仅为79.2%~80.7%,且显示出明显的地域性。     

中国禽源新城疫病毒(NDV)流行株F和HN基因的遗传演化和变异频率

【目的】新城疫(ND)是中国流行最严重的疫病之一,对家禽业可造成巨大的经济损失,疫苗防控是控制ND的重要措施。新城疫病毒(NDV)流行株的遗传演化一直是研究NDV的焦点。本文利用分子信息学手段,通过比较近20年间NDV流行株不同基因型F和HN基因的分子特征和遗传变异频率,解析免疫压力下NDV的演化规律。【方法】利用Lasergene 7.1和MEGA5.1软件,选取本实验室89株NDV分离株,结合从Gen Bank下载的364株NDV流行株以及15株NDV经典毒株的基因序列,对其进行系统发育、分子特征和替代频率分析。【结果】系统发育表明,NDV已经演化为15个基因型。一致性比较显示,NDV流行株相同基因型之间核苷酸(氨基酸)高度同源,而不同基因型之间差异较大且存在明显的氨基酸变异积累。NDV基因型的分布与时间、地域密切相关,VII d亚型为中国NDV优势流行株。为评估NDV变异的频率,以Go/GD/QY/1997株(中国较早发生的基因VII亚型)为参照,1997-2015年间NDV的F/HN基因的年平均核苷酸(氨基酸)替代率为2.31×10~(-3)(2.26×10~(-3))/3.37×10~(-3)(2.35×10~(-3))。其中,1997-2001年(未使用基因VII型疫苗)F/HN基因核苷酸年平均替代率为4.72×10~(-3)/8.28×10~(-3);2002-2015年(疫苗使用后)为1.6×10~(-3)/1.84×10~(-3),显示出基因VII型疫苗在控制NDV变异速度方面具有明显的效果。【结论】生物信息学分析证实:研制出与NDV流行毒株相匹配的新型疫苗是控制当前NDV变异的关键。     

华南地区新城疫病毒HN基因的克隆及其系统发育分析

用RT PCR一步法扩增了华南地区NDV野毒HN基因 ,并对其中的 3株的HN基因 897bp片段进行了克隆、测序及同源性分析。本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析 :中国华南地区NDV各毒株与欧美国家Ⅰ至Ⅴ基因型明显分离 ,遗传关系较远。台湾省的NDV各毒株归属为一型 ,并且与华南株的遗传距离较近。NDV华南FS1株不能归类到任何一个基因型中。广东地区从鹅群中分离到的副粘病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDVFS2株有很近的亲缘关系     

华南地区新城疫病毒HN基因的克隆及其系统发育分析

用RT-PCR一步法扩增了华南地区NDV野毒HN基因, 并对其中的3株的HN基因897bp片段进行了克隆、测序及同源性分析.本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析中国华南地区NDV各毒株与欧美国家Ⅰ至Ⅴ基因型明显分离,遗传关系较远.台湾省的NDV各毒株归属为一型,并且与华南株的遗传距离较近.NDV华南FS1株不能归类到任何一个基因型中.广东地区从鹅群中分离到的副粘病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有很近的亲缘关系.     

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。     

人癌胚抗原与新城疫病毒HN基因共表达载体的构建及表达

注射肿瘤疫苗 ,诱发机体产生特异性抗肿瘤免疫 ,是肿瘤生物治疗及手术后预防肿瘤复发、转移的重要手段之一。肿瘤核酸疫苗较重组蛋白或多肽疫苗来说 ,具有无可比拟的优点 ,它可同时诱导体液免疫和细胞免疫 ,后者在肿瘤免疫中起关键作用。传统的肿瘤疫苗是经各种方法灭活后的自体瘤苗 ,它虽可以诱导细胞免疫 ,但仍存在着灭活不彻底 ,导致人为瘤细胞种植的潜在危险 ,况且从操作性方面也较为繁琐、复杂。肿瘤抗原往往抗原性较弱 ,尤其是相关抗原 ,在某些正常组织中也有微量的表达 ,这容易使机体免疫系统对它产生免疫耐受 ,因此在激发肿瘤特异性…     

新城疫分离毒HN蛋白的抗原性初步分析及分子特性研究

运用针对NDV囊膜糖蛋白(HN)的单克隆抗体(MAbs), 对2005~2006年间自我国江苏和广西部分地区的20株NDV分离株进行排谱试验, 初步分析了不同毒株之间HN蛋白的抗原表位差异; 并应用RT-PCR技术成功扩增了其HN基因整个编码区, 经克隆、测序最终获得13株鸡源NDV与7株鹅源NDV HN基因的编码区序列, 分析测定核苷酸序列及推导的氨基酸序列, 并将 鹅源NDV与鸡源NDV相应序列进行了比较。结果单抗排谱试验表明, 20株NDV分离株之间 HN蛋白的抗原表位存在差异; 测序结果表明, 测定的HN基因的编码区长度皆为1716nt编码571个氨基酸; 分离株中18株基因Ⅶ型NDV分离株之间HN基因编码区核苷酸序列具有较高的同 源性,达94.8%~100%; 与近几年国内流行的其它基因Ⅶ型NDV之间的核苷酸序列同源性 为92.1%~99.6%。对其推导的HN蛋白一级结构中潜在的糖基化位点及HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列等进行了比较分析。结果显示, 单抗排谱差异显著株在部分氨基酸位点发生了突变; 同时揭示我国部分地区同期流行的鹅源NDV与鸡源NDV HN基因之间具有较近的亲缘关系。     

新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究

选取国内1999~2004年分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树。利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r)。利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较。结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%~99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%~89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55)。     

新城疫不同毒株交叉鸡胚中和指数及其与F和HN基因变异的相关性

选取13株国内2001～2004年分离的新城疫流行病毒(Newcastle disease virus,NDV),经蚀斑纯化,克隆其融合蛋白(F)和血凝素.神经氨酸酶(HN)基因,结合疫苗株La Sota、Clone30和国内标准强毒株F48E9等的基因序列,进行遗传变异分析.利用纯化的病毒制备特异阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,确定不同NDV毒株之间的抗原相关性,并与NDV不同毒株之间的HN和F基因核苷酸(氨基酸)同源性进行相关比较.结果表明:病毒中和指数与HN基因的核苷酸(氨基酸)同源性显著相关(P<0.01,r=-0.35),与F基因呈弱相关(P<0.05,r=0.20),而与F基因前374bp的核甘酸同源性不相关.这表明,NDV的分子变异已经对NDV的抗原性变异产生了影响,研制新型的疫苗成为必然.     

新城疫病毒分离株HN和P基因分子进化及其相关研究

为探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)和磷蛋白(P)基因遗传特性以及相互关系,将1997～2005年间国内分离到12株NDV毒株,分别进行HN和P基因克隆测序,结合15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株HN和P基因,计算所有毒株HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段进化距离,利用统计软件进行了不同片段间进化距离的方差分析,HN或P基因核苷酸进化距离与毒株分离时间、HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间的相关分析.统计分析显示:NDV HN或P基因不同核苷酸和氨基酸序列片段变异程度不一样;不同毒株间HN或P基因片段与其全长间以及HN和P基因全长间无论是核苷酸还是氨基酸遗传变异高度相关.以上说明,NDV HN和P基因虽以不同的方式进化,但是HN和P基因遗传变异的趋势是相同的.HN和P基因的变异与分离时间有一定的联系.     

NDV山东分离株的生物学特性及其HN基因的克隆与序列分析

2004年从山东某鸡场发病蛋鸡群中分离到一株新城疫病毒（编号：ShD-2-04）,对其生物学特性进行了研究,并对其HN基因进行了克隆和序列分析。结果表明：该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间（MDT）为50．4,1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数（ICPI）为1．85,6周龄SPF鸡静脉接种致病指数（IVPI）为2．42,表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征;其HN基因开放性阅读框架（ORF）为1,716bp,编码571个氨基酸;与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性在81．6％-87．2％之间,氨基酸同源性在87．6％-90．7％之间。     

4株鹅源新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及序列分析

测定了4株鹅源新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因5’端1700核苷酸片段的序列,并由此推导了F蛋白氨基酸序列,并对鹅源NDV的基因型分类地位进行探讨。结果表明,4株病毒F基因的同源性大于97%,与DNV标准强毒株F48E8 F基因的同源性为860%～868%,F基因转录起始序列及起始密码子位置与已知NDV完全相同;F蛋白具有和已知NDV相似的各种功能区,F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征。对F基因第334～1682位核苷酸之间3种限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ\,\%Rsa\%Ⅰ酶切图谱的分析表明,4株病毒的基因型与文献报道的I～Ⅷ型有明显差异。     

新城疫分离毒HN基因的分子特性和片段同源相关性

选取国内1997-2005年分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)24株,经蚀斑纯化克隆其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因,与在GenBank发表的36株国内外不同时期的NDV毒株,进行氨基酸遗传变异分析,并利用SPSS8.0软件对其不同片段的氨基酸进行同源相关比较。结果显示:国内所有NDV分离毒株氨基酸高度同源,同源性为94.4%-99.4%;与LaSota、Clone30疫苗株等的氨基酸同源性为86.9%-89%;与强毒株F48E9的氨基酸同源性为87.9%-89.9%;与国外NDV的氨基酸同源性为87.2%-96.2%。系统发育分析表明:国内NDV分离毒HN遗传距离较近,而与LaSota、Clone30和F48E9遗传距离较远。国内NDV分离毒均缺乏538-540位糖基化位点。不同片段与全长的氨基酸同源性高度相关,且与前80个氨基酸相关最密切。