GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

上海复旦大学附属儿科医院急性下呼吸道感染患儿常见病毒的检测及临床研究

目的 建立套式反转录-聚合酶链反应(nested-RT-PCR)检测临床样本鼻病毒(human rhinovirus,HRV)基因的方法和直接免疫荧光(DFA)的方法对常见呼吸道病毒病原进行检测,了解上海儿科医院小儿急性下呼吸道感染(ALRTI)中病毒感染的现状.方法 收集住院确诊为ALRTI患儿的深部鼻咽分泌物(NPS)标本.用套式RT-PCR的方法检测NPS中的HRV基因,并进一步对扩增产物进行序列分析;用DFA的方法检测NPS中的呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)抗原.并分析各种病毒所致ALRTI的临床特点及流行特征.结果 342例患儿除细菌感染外共130例病毒抗原阳性,其中检测出RSV 64例(18.70%),1岁以下婴儿的RSV检出数为71.8%.RSV 8月份起检出率逐渐升高,到12月份达到最高;HRV阳性患儿46例(13.45%),3岁以下婴幼儿检出例数有38例,占HRV检出数的82.6%.HRV致ALRTI全年可见,在3到5月为最高峰;ADV感染9例(2.63%);PIV感染8例(2.3%);IFV感染7例(2.0%);病毒合并感染共有4例.46例HRV阳性标本中选取15份用另1对引物扩增并测序,测得的核苷酸序列经过blast比较,与GenBank中已知HRV序列的同源性在83%～97%,样本间的序列比较提示变异性较大.130例病毒性ALRTI患儿绝大部分诊断为支气管肺炎.以中等度发热为主,末梢血白细胞＜10×109/L 93例(71.5%),CRP＜8 mg/L 99例(76.2%),符合病毒性肺炎的特点,并发症较少,均治愈出院.结论 本地区小儿病毒性ALRTI中,以RSV及HRV占为主要地位,ADV、PIV及IFV相对少见.较少有混合性病毒感染.HRV所致小儿ALRTI以婴幼儿居多,集中于春、秋两季.套式RT-PCR检测HRV基因快速、操作简便、特异性较强,HRV基因组具有高度变异的特点.     

呼吸道合胞病毒在北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲＴ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中,经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率为６５％,由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％,氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区     

七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术的初步建立

由呼吸道病毒引起的疾病严重威胁着人类的生命健康,为了建立一种快速高通量的呼吸道病毒核酸检测方法,本研究将多重PCR技术同液相芯片技术结合起来,针对呼吸道合胞病毒A型和B型、乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系、甲型流感病毒H1型和H3型以及新冠病毒等常见的七种呼吸道病毒,初步建立了七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术,评价了方法的特异性、敏感性和重复性,并使用来自安徽省疾控的25份临床急性期样本核酸对方法进行验证。结果显示,建立起的基于液相芯片多重核酸检测方法可特异性识别七种目标呼吸道病毒的靶基因序列,与包括副流感病毒在内的9种非目标呼吸道病毒无交叉反应。对七种病毒核酸进行十倍稀释液相检测,其中H3、BV、RSVB可以检出10²拷贝/μL,BY、RSVA和SARS-CoV-2可以检出10³拷贝/μL,对H1的检测限为10⁴拷贝/μL。25份样本核酸检测结果与实际相符。结果表明,本研究建立的七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点,可用于临床样本的快速检测,为呼吸道类传染病的液相...     

503例儿童急性呼吸道感染常见病毒的检测结果分析

目的通过对503例急性呼吸道感染患儿进行7种常见病毒[流感病毒A、B型（IVA、IVB）,腺病毒（ADV）,副流感病毒1、2、3型（PIV1、PIV2、PIV3）及呼吸道合胞病毒（RSV）]的检测,了解本地区2013年急性呼吸道感染患儿的病毒感染状况。方法应用免疫荧光法对503例急性呼吸道感染患儿的咽拭子进行7种常见病毒的检测。结果 503例患儿中有55例检出病毒阳性,总阳性率为10.93%,均为单一病毒感染。7种常见病毒中,RSV的感染率最高,为76.36%。在各年龄组中,〈1岁组的病毒检出率最高,为29.41%,随着年龄的增长,检出率逐渐降低。从季节分布来看,春季的感染率最高,为23.08%,其次为冬季,感染率10.13%。结论 RSV是2013年本地区儿童急性呼吸道感染的主要病毒,〈1岁组患儿的病毒检出率最高,春季为感染的高发季节。     

利用寡核苷酸微阵列技术对HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19进行同时监测的初步研究

探讨研制能同时检测HBV、HCV、HIV、HAV、GBV-C/HGV和B19的微阵列监控芯片。根据病毒公开发表序列,序列比对,得出保守区域,设计病毒的特异性检测探针,同时设置阴性、阳性参照探针,制备监控微阵列。利用随机引物PCR方法标记样品中的病毒靶序列,标记产物与微阵列上的探针杂交,清洗、扫描后进行结果分析。通过对质粒或模式分子的检测以及经HBV、HCV、HIV临床标本的验证,发现该微阵列监控芯片具有良好的特异性。其对质粒的检测灵敏度可达102病毒拷贝数,对临床标本的检测灵敏度可达103病毒拷贝数。此外,该微阵列监控芯片可检测出病毒混合感染血清。为微阵列监控芯片应用于此六种血液病毒的检测打下一定的基础。     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3’端基因高变区核苷酸序列与RSVGA2亚型的同源性最高。提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSVGA2亚型。     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树.结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3'端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性最高.提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSV GA2亚型.     

西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒的初步研究

本研究为了解西藏地区儿童急性呼吸道感染中呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)及基因型别。首先采用直接免疫荧光法检测2011年4～7月西藏自治区人民医院儿科病房因急性呼吸道感染住院患儿的鼻咽分泌物标本中7种常见的呼吸道病毒及人类偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)的抗原。然后对RSV抗原阳性的标本分别提取RNA,用逆转录-巢式聚合酶链反应法(Nest-PCR)确定RSV型别,同时用实时荧光PCR(Real-Time PCR)方法进行验证。再通过对G蛋白基因PCR扩增产物序列测定确定RSV的基因型。通过与GenBank中不同地区RSV分离株的G蛋白基因序列比对,了解西藏地区RSV G蛋白的结构特点及变异情况。结果表明,从167例标本中检测出呼吸道病毒抗原阳性的为65例,总阳性率为38.9%(65/167),其中RSV 45例,占阳性标本的69.2%(45/65),对其中42例RSV阳性标本进行了PCR分型,其中40例为A亚型,2例为B亚型。对7株A亚型RSV G蛋白基因PCR产物测序结果显示,全部为GA2基因型。西藏RSV与RSV原型株A2株核苷酸的同源性为90.7%～91.8%,氨基酸的同源性只有86.5%～87.2%。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守序列的两端。7株西藏A亚型RSV G蛋白的核苷酸序列与GenBank中不同的RSV分离株相比同源性为90.7%～91.8%。西藏地区2011年春季小儿急性呼吸道感染的病毒病原主要为呼吸道合胞病毒,A亚型是2011年西藏地区的流行优势型别,其G蛋白胞外区基因具有较高的变异性。     

我国呼吸道合胞病毒抗原亚型的初步探讨

An analysis of subtypes of 9 respiratory syncytial (RS) viruses isolated from Guangzhou and Nanjing areas of china was carried out with eight Sweden RS-subtype specific monoclonal antibodies (MAbs) and 7 internal anti-RS MAbs. All these MAbs directed against respectively the large Glycoprotein (G), fusion protein (F), nucleoprotein (NP), and phosphoprotein (P) components of the prototype Long strain of RS virus. The patterns of the reactions of these MAbs to the nine isolated strains of RS virus were compared with indirect immunofluorescence assay (IFA), alkaline phosphoesterase-anti alkaline phosphoesterase (APAAP) enzyme-linked assay and Western blotting. The antigenic variations were founded among the strains of RS virus, and two subtypes allocated to the subtype A and B of RS virus by using the eight RS-subtype specific MAbs. Seven out of the 9 isolated strains of RS virus belonged to the subtype A, and two were being to the subtype B. The antigenic diversities were also founded within the same subtype, and the main pronounced difference were observed on the G glycoprotein by using the internal anti-RS MAbs. These findings are potentially important both for vaccine development and for the understanding of clinical and epidemiological characteristics of RS virus.     

Microarray Multiplex Assay for the Simultaneous Detection and Discrimination of Influenza A and Influenza B Viruses

In this study, we present a microarray approach for the typing of influenza A and B viruses, and the subtyping of H1 and H3 subtypes. We designed four pairs of specific multiplex RT-PCR primers and eight specific oligonucleotide probes and prepared microarrays to identify the specific subtype of influenza virus. Through amplification and fluorescent marking of the multiplex RT-PCR products on the M gene of influenza A and B viruses and the HA gene of subtypes H1 and H3, the PCR products were hybridized with the microarray, and the results were analyzed using a microarray scanner. The results demonstrate that the chip developed by our research institute can detect influenza A and B viruses specifically and identify the subtypes H1 and H3 at a minimum concentration of 1 × 10² copies/μL of viral RNA. We tested 35 clinical samples and our results were identical to other fluorescent methods. The microarray approach developed in this study provides a reliable method for the monitoring and testing of seasonal influenza.     

基因芯片技术在病毒性病原体检测中的研究进展

基因芯片技术具有高通量、高度平行性、高度自动化的特点。在对传染病病原体的研究中,基因芯片技术已应用于耐药性相关遗传多态性分析、基因分型、生物种系的遗传进化分析、宿主与病原体相互关系分析、病原体检测等。但在病原体检测方面,与检测细菌相比,基因芯片技术对病毒的高通量检测难度较大。简要介绍了目前基因芯片技术在病毒性病原体检测中的研究进展、所采用探针的类型及设计原则、基因芯片杂交结果的影响因素等。     

AIV血凝素亚型同步检测基因芯片技术研究

对流感病毒14个血凝素亚型的基因芯片检测技术进行了初步研究。通过RT-PCR克隆禽流感病毒血凝素基因片段,获得重组质粒。从重组质粒扩增大约500bp的DNA片段,浓缩后点到氨基化玻璃载体上,制成芯片。待检病毒样品用TRIzolLS提取RNA,反转录过程中用Cy5标记样品cDNAs。将标记样品与芯片杂交,扫描芯片上待检样品与芯片上捕捉探针的结合位点,杂交信号与预期设想一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV血凝素亚型鉴别诊断方法。     

DNA微阵列技术在阿尔茨海默病及其防治药物研究中的应用

在生物技术飞速发展的今天,DNA微阵列已成为功能基因组时代大规模、高通量乃至全基因组表达和功能研究的有力工具。阿尔茨海默病,因其发病机制复杂,迄今尚无定论,因此在临床上也缺乏有效的防治药物。简要综述DNA微阵列技术应用于阿尔茨海默病发病机制、早期诊断及防治药物等方面的研究进展。     

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus; HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变.利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr;B基因型6例,其血清型均为adw.在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204 V/rtL180M,其中2例野生株和变异株共存.rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异.10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异.进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBV DNA水平、ALT值无关联.HBV基因芯片可初步用于HBV DNA 检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一.     

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus;HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变。利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr;B基因型6例,其血清型均为adw。在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204 V／rtL180M,其中2例野生株和变异株共存。rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异。10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异。进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBVDNA水平、ALT值无关联。HBV基因芯片可初步用于HBV DNA检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一。     

制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究

建立制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的技术,并探讨研制检测炭疽芽胞杆菌基因芯片的方法。酶切炭疽芽胞杆菌的毒素质粒和荚膜质粒,通过建立质粒DNA文库的方法获取探针,并打印在经过氨基化修饰的玻片上,制成用于炭疽芽胞杆菌检测的基因芯片。收集了290个阳性克隆探针,制备了检测炭疽芽胞杆菌的基因芯片。提取炭疽芽胞杆菌质粒DNA与基因芯片杂交,经ScanArray Lite芯片阅读仪扫描得到初步的杂交荧光图像。通过分析探针的杂交信号初步筛选出273个基因片段作为芯片下一步研究的探针。     

用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV

为从临床样品中检测和分析SARSCoV病毒打基础,并为分析SARSCoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片,探针长度为70nt,每相邻的探针序列重复25nt,共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARSCoV病毒总RNA、7个SARSCoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTPcy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARSCoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布,并且有多处连续的阳性信号点;用正常人的白细胞RNA为对照,杂交未出现明显阳性信号。检测7个SARSCoV病毒基因克隆片段,在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。     

基因芯片技术检测3种食源性致病微生物方法的建立

建立一种运用多重PCR和基因芯片技术检测和鉴定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157的方法, 为3种食源性致病菌的快速检测和鉴定提供了准确、快速、灵敏的方法。分别选取编码志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)、沙门氏菌肠毒素(stn)基因和致泻性大肠杆菌O157志贺样毒素(slt)基因设计引物和探针, 进行三重PCR扩增, 产物与含特异性探针的芯片杂交。对7种细菌共26株菌进行芯片检测, 仅3种菌得到阳性扩增结果, 证明此方法具有很高的特异性。3种致病菌基因组DNA和细菌纯培养物的检测灵敏度约为8 pg。对模拟食品样品进行直接检测, 结果与常规细菌学培养结果一致, 检测限为50 CFU/mL。结果表明：所建立的基因芯片检测方法特异性好, 灵敏度高, 为食源性致病菌的检测提供了理想手段, 有良好的应用前景。     

SARS病毒再测序DNA微阵列的探针设计

探针设计是SARS病毒再测序DNA微阵列制作的关键步骤,为了保证探针的杂交条件尽可能一致,采用了作者提出的两种等长变覆盖的探针设计方法,即基于Tm距离的算法和遗传算法。针对SAILS病毒基因组中的两段特异序列设计了一组探针,并与等长移位法和变长变覆盖法的设计结果进行了比较。等长变覆盖法得到的探针集在探针长度一致的情况下,探针的Tm值有较小的标准差和变化范围。结果表明,等长变覆盖法得到的探针具有更好的杂交条件一致性。