热稳定性酶

酶的热稳定性是酶的重要属性之一。任何导致酶的空间结构变化的因素都影响酶的热稳定性,包括酶液的ｐＨ、缓冲液、离子强度、底物浓度、溶剂等等。热稳定性酶具有提高化学反应速率,简化工艺,降低成本,提高产品质量,活性稳定,耐贮藏等优点。所以寻找热稳定性酶,提高...     

嗜热酶的结构特征与热稳定性

相对于嗜温酶,嗜热酶作为生物催化剂有许多优势而受到人们的广泛重视。嗜热酶的热稳定性机制历来是生物化学家们研究的重点。本文综述了嗜热酶的结构特征及其与热稳定性的关系。相对于嗜温酶,嗜热酶的结构比较僵硬,折叠紧密,廿螺旋更长,构象张力低,大多数为多聚体。了解嗜热酶的结构特征与热稳定性的关系,对于采用酶工程改造嗜温酶从而提高其热稳定性具有重要的指导意义。     

黑曲霉(Aspergillus niger)Uγ-2菊粉酶保护剂的研究

研究菊粉酶热稳定性,菊粉酶在60℃具有较好的热稳定性;一些醇类物质和增稠剂可以提高菊粉酶的热稳定性;利用甘油、美原胶和CaCl2设计三因素三水平的正交试验,确定了以6％的甘油,0．6％的黄原胶,100mmol／L的CaCl2组合的保护剂,对提高酶的热稳定性具有显著作用。     

应用拉氏图信息提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶催化性能

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是用于催化L-谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate,GABA)的唯一酶,提高GAD的催化活力或热稳定性,有利于GABA的高效制备和生产。以热稳定性和活性为筛选目标,通过研究短乳杆菌GAD1407三维模拟结构的拉氏图,确定不稳定氨基酸残基位点K413,采用定点突变的方法构建该位点的突变体,并测定野生型酶和突变酶的热稳定性和活力。结果表明突变酶K413A和突变酶K413I分别在热稳定性和酶活力上获得了提高,突变酶K413A在50℃的半衰期为105 min,是野生酶的2.1倍;突变酶K413I热稳定性没有明显的提高,但其酶活力却得到了有效提高,约为野生型的1.6倍。因此,通过拉氏图提供的结构信息可为利用理性设计提高GAD活性和热稳定性提供指导。     

过氧化氢酶Ⅰ结构延伸突变改善酶热稳定性的初步研究

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶Ⅰ及其取代突变酶８８（２５）的延伸突变是指在酶蛋白的Ｃ末端上连接一段随机肽链,从而改变了酶蛋白的结构．研究结果表明,这种延伸突变的方法非常有效地提高了酶的热稳定性,并且随机肽链的疏水性与其对应的延伸突变体酶的热稳定性呈现一定的负相关性,即随机肽链的疏水性越高,对应的突变体酶热稳定性越低     

过氧化氢酶Ⅰ结构延伸突变改善酶热稳定性的初步研究

嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶Ⅰ及其取代突变酶８８（２５）的延伸突变是指在酶蛋白在Ｃ末上连接一段随机肽链,从而改变了酶蛋白的结构,研究结果表明,这种延伸突变的方法非常有效地提高了酶的热稳定性,并且随机肽链的疏水性一与其对应的延伸突变体酶的热稳定性呈现一定的负相关性,即随机肽链的疏水性越高,对应的突变体酶热稳定性越低。     

黑曲霉(Aspergillus niger) Uγ-2菊粉酶保护剂的研究*

研究菊粉酶热稳定性,菊粉酶在60℃具有较好的热稳定性;一些醇类物质和增稠剂可以提高菊粉酶的热稳定性;利用甘油、黄原胶和CaCl₂设计三因素三水平的正交试验,确定了以6%的甘油,0·6%的黄原胶,100mmol/L的CaCl₂组合的保护剂,对提高酶的热稳定性具有显著作用。     

超高温菌酶构象的刚性和热稳定性的相互关系

超高温菌酶具有优良的高温热稳定性,其酶蛋白结构中的氢键、离子对、盐桥和极化表面面积等均高于中温酶,有利于增强其构象的刚性,从而增加其热稳定性。超高温菌酶在中温时比它们的中温同系物更具有刚性,并且刚性是超高温菌酶在高温环境下保持其热稳定性的先决条件。     

嗜热酶的耐热机理

酶蛋白在高温下的不稳定性是影响其广泛应用的主要瓶颈,嗜热酶因为独特的性质而被作为热稳定研究的极好材料。了解嗜热酶的热稳定性机制,对于采用酶工程定向设计、改造酶具有重要的意义。嗜热酶的热稳定性并不是由单一因素决定的,氨基酸组成、氢键、离子对、二硫键等都是影响嗜热酶热稳定性的重要因素。相对于嗜温酶,嗜热酶更多地采用寡聚体的形式。     

49P（del）点突变提高中性纤维素内切酶EGV热稳定性的初步研究

目的：探讨利用点突变方法改善EGV热稳定性的可能性和有效性。方法：对来源于Melanocarpus albomyces endoglucanase的耐热性纤维素酶maEG进行同源建模和序列比较,删除49位脯氨酸49P（del）进行定点突变,并将得到的突变体在毕氏酵母X33中表达,对表达产物进行酶活性和热稳定性检测。结果：突变酶49P（del）在70℃处理120min,热稳定性比EGV提高了21．6％,且突变酶其他性质与野生型酶基本相似。结论：通过对中性纤维素内切酶EGV的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为进一步研究其结构和功能提供了材料。结果同时表明利用生物信息学和分子模拟技术,缩短表面环区对于酶的热稳定性有一定的作用。     

利用脯氨酸效应提高短乳杆菌谷氨酸脱羧酶的热稳定性

以磷酸吡哆醛为辅酶的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD),能专一、不可逆地催化L-谷氨酸脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。为了提高GAD热稳定性为目标,本研究通过与嗜热古细菌Thermococcus kodakarensis中GAD氨基酸序列的比对及引入脯氨酸策略,最终在短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCC No.1306的GAD突变体中筛选得到热稳定性提高的突变酶G364P。结果显示,突变酶G364P在55℃的半衰期以及半失活温度分别比野生酶提高19.4 min和5.3℃,并且突变酶G364P的催化效率与野生酶相比没有明显变化。此外,利用分子动力学模拟来验证突变对蛋白质热稳定性的影响,突变酶G364P的均方根偏差(Rootmeansquare deviation,RMSD)以及含G364的loop区域均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)均比野生酶低,引入脯氨酸增加了364位氨基酸与相邻氨基酸的疏水相互作用。文中通过引入脯氨酸成功提高了L. brevis中GAD的热稳定性,同时也为其他酶热稳定性的理性设计提供了方法学指导。     

无机离子和有机溶质对α-淀粉酶热稳定性的影响

长期以来,如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、生物工程学、化学工业等所关注的重要研究课题之一。分析了多种无机离子、糖和氨基酸对枯草杆菌液化型α-淀粉酶热稳定性的影响以及它们的共存效应,获取了一些对相关研究领域具有理论参考和实际应用价值的实验结果。在无机盐中,1mmol/L的钙离子或50mmol/L的钠离子能显著地提高该酶的热稳定性;酸性氨基酸和碱性氨基酸表现出相反的结果：酸性氨基酸具有明显的增强作用,碱性氨基酸却使之降低;随着糖浓度的增加（0～1000mmol/L）,该淀粉酶的热稳定性呈线性增高;当钠离子或钾离子与某些氨基酸或糖类共同存在时,对该淀粉酶的热稳定性表现出了明显的协同作用。试图通过检测酶蛋白分子荧光强度改变来反映该酶的热稳定性变化,其结果是：随着温度的改变,酶蛋白的荧光强度的衰减与残余酶活性之间显示了良好的相关性。从而说明热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,某些溶质的存在可能是通过作用于蛋白质分子的立体结构而影响该酶的热稳定性。     

易错PCR法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性

摘要:【目的】对土芽孢杆菌(Geobacillus sp.) ZH1的羧酸酯酶基因进行定向进化,筛选得到酶热稳定性提高的突变酶。【方法】利用易错PCR技术向羧酸酯酶基因中随机引入突变,建立酶基因突变文库,筛选获得热稳定性提高的突变体,并对突变酶进行诱导表达、纯化及部分酶学性质研究。【结果】通过筛选,获得羧酸酯酶热稳定性提高的突变菌株65。序列分析表明,突变酯酶65有2个氨基酸发生了改变,包括T113S和M160K。突变酶的三维结构模拟显示,突变T113S位于酶分子的第5个β-折叠上;突变M160K处在酶分子第5个和第6个α-螺旋之间的环结构上,位于酶分子表面,突变后的Lys160与邻近的Thr162形成一个额外氢键。在90 ℃下,突变酶65和亲本酶的半衰期分别为3.1 h 和1.9 h,表明筛选到的突变酶65比亲本酶的热稳定性好。【结论】基于易错PCR技术对Geobacillus sp．ZH1羧酸酯酶的热稳定性进行了定向进化,对改善酶的性质、扩大酯酶的应用范围,以及研究酯酶的结构与功能的关系具有重要意义。     

抗体对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的热稳定性的影响

采用不同的固定化方法制备了三种固定化猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶,其中琼脂糖-抗体-乙酰胆碱酯酶热稳定性最好。抗体与热稳定性最差的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶反应后,酶的热稳定性明显提高。抗体还能部分恢复热失活的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶的活力。酶与抗体反应前后的表观米氏常数K_m及反应速度没有明显变化,表明抗体是结合在酶的非活性部位,没有或很少影响酶的活性中心的构象。     

抗体对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的热稳定性的影响

采用不同的固定化方法制备了三种固定化猪脑尾状核乙酰胆碱酯酶,其中琼脂糖-抗体-乙酰胆碱酯酶热稳定性最好。抗体与热稳定性最差的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶反应后,酶的热稳定性明显提高。抗体还能部分恢复热失活的琼脂糖-青豌豆植物凝集素-乙酰胆碱酯酶的活力。酶与抗体反应前后的表观米氏常数K_m 及反应速度没有明显变化,表明抗体是结合在酶的非活性部位,没有或很少影响酶的活性中心的构象。     

三乙醇胺基强碱性聚苯乙烯树脂共价固定胰酶的研究

用多孔强碱型三乙醇胺基聚苯乙烯阴离子交换树脂做为载体,用CNBr与载体上的多羟基作用共价偶联了胰酶。红外光谱表明:其共价偶联反应机理与用CNBr活化多糖类载体并接酶的机理相类似。最适偶联条件研究表明:CNBr用量增多,酶蛋白载量增加。但比活下降。偶联pH为10时,固定化酶有适宜的载量和较高的比活。由于胰酶水解蛋白反应释放出H~+质子,这些质子在载体内积累,使微环境内H~+质子浓度增加,进而使得固定化胰酶的pH—活性曲线在pH9～11范围内未出现下降。在变温和60℃恒温下对固定化酶的热稳定性测试表明:固相酶的热稳定性比天然酶的热稳定性有所提高。     

固定化酶的微环境效应—载体离子基团性质的影响

作者合成了阴离子型和阳离子型葡聚糖,以此为载体,用CNBr活化其剩余羟基,固定化了葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶。就离子型载体对固定化酶的蛋白载量、最适pH和热稳定性等的影响做了考察。发现固定化酶的蛋白载量不仅与载体的电性质有关,也与酶分子自身的电性质有关。当载体电性质与酶蛋白电性质相反时,固定化酶的蛋白载量增加,热稳定性提高、载体电性质与酶蛋白电性质相同时,固定化酶的蛋白载量不变或下降,其热稳定性不变。作者还发现当离子型载体孔度和体系缓冲液浓度一定时,酶分子能否进入多孔性载体内部,对其最适pH是否变化影响极大。若酶分子仅被连接在载体的外表层,其最适pH不发生变化,反之亦然。作者还观察到当多糖类载体引入氨基或羧基后,大大增强了其抵抗微生物侵蚀的能力。     

定点突变提高苯丙氨酸羟化酶的热稳定性

嗜热菌中,蛋白质存在Ala替换Gly以及Arg替换Lys的趋势。为了提高紫色色杆菌来源的苯丙氨酸羟化酶的热稳定性,将该酶中所有Gly突变成Ala,Lys突变成Arg,筛选获得热稳定性提高的突变体,并进行组合突变,对突变酶的酶学性质进行研究。结果表明,突变酶K94R和G221A在50℃的半衰期分别为26.2 min、16.8 min,比原始酶(9.0 min)分别提高了1.9倍、0.9倍,同时组合突变酶K94R/G221A在50℃处理1 h后仍保留65.6%的酶活,比原始酶(8.6%)高出6.6倍。圆二色谱结果显示原始酶和突变酶K94R、G221A及K94R/G221A的T_m值分别为51.5℃、53.8℃、53.1℃和54.8℃。蛋白三维结构模拟推测突变体热稳定性提高机理为:突变体K94R中Arg94与Ile95之间形成额外氢键,稳定其所在的柔性区域;突变体G221A中Ala221与Leu281产生疏水作用,稳定酶分子C-端柔性区。该研究结果为蛋白质热稳定性改造提供了参考,也为苯丙氨酸羟化酶在功能性食品领域的应用奠定了基础。     

基于序列和结构分析的酶热稳定性改造策略*

功能酶被广泛应用于食品、化工、医药等领域,但却容易受高温环境限制,导致催化效率降低。以分子改造为目的的蛋白质工程技术是解决这一问题的关键环节,其能够对酶结构和功能进行改造,获得热稳定性好的工业酶。传统的定向进化方法只能依靠随机突变进行人工筛选,具有效率低、针对性差等缺点;理性设计作为酶热稳定性改造的主要方法,可借助各种计算机程序和软件预测潜在突变位点,但其要求对酶的催化机制、热稳定性机制有深入了解。对于大多数天然酶而言,酶的序列和晶体结构是最容易获取的信息,也是预测功能的重要基础。从酶的序列和晶体结构入手,重点介绍了共识突变、基于序列偏好性的突变、截短柔性区域、优化分子内相互作用力、刚化催化活性区域及计算机辅助筛选柔性位点等常用策略,这些策略具有筛选效率高、改造准确性高、实用性强等优点。结合多种酶的热稳定性改造案例进行分析,旨在为不同酶的改造策略选择提供有效参考,同时也为工业酶的耐热性研究提供理论支持。     

N-琥珀酰壳聚糖固定化中性蛋白酶的制备及性质研究

以N-琥珀酰壳聚糖为载体固定中性蛋白酶,研究了固定化酶的适宜温度、pH、热稳定性和酸碱稳定性等酶学性质,同时对固定化酶和游离酶的红外光谱图作了分析比较.结果表明:中性蛋白酶经固定化后,最适酶反应pH由7升至8,最适温度没有改变,仍为50℃,所得固定化酶具有较宽的酸碱稳定性范围,在pH 7～9都保持较高活力,并且同定化酶的热稳定性比游离酶有较大的提高.红外光谱分析表明,酶固定化前后的红外光谱图的部分特征峰有较大的差异.