高产葡萄糖异构酶菌种选育

本文介绍了以甜菜糖蜜为原料生产葡萄糖异构酶的新菌种游动放线菌Ｅ２１５的选育及工艺条件试验、菌种Ｅ２１５摇瓶最高产酶７７２单位,１０立升发酵罐产酶５７０单位,发酵周期７２小时,胞外酶含量１０％以下,产酶性能稳定。     

低温脂肪酶产生菌的筛选、产酶发酵及粗酶性质研究

利用含有Tween 80的琼脂平板和摇瓶发酵法,从若尔盖高原土壤中筛选产脂肪酶菌株.通过菌落形态和菌体特征观察初步对菌种进行鉴定,得到一株产低温脂肪酶的适冷菌Pseudomonassp.DL-B,并设计正交试验对该菌株的产酶发酵培养条件进行了优化.摇瓶实验表明,该菌株最适产酶发酵培养基为:蔗糖10 g/L,蛋白胨20 ...     

重组角质酶的发酵制备及其对涤纶纤维的表面改性

对大肠杆菌表达嗜热子囊菌Thermobifida fusca角质酶的摇瓶诱导条件及3 L发酵罐扩大培养进行了研究,并探讨了角质酶对涤纶纤维的改性作用。结果表明,在摇瓶培养中,采用工业级TB培养基,用2 g/L乳糖诱导,菌体培养至对数生长前期添加0.5％甘氨酸,角质酶产量可达到128 U/mL。在3 L发酵罐扩大培养中,补料培养生物量 (OD600) 最大达到35,角质酶酶活最高达506 U/mL,是迄今国内外报道细菌来源角质酶的最高水平。紫外分光光度法分析初步表明涤纶纤维经角质酶水解产生了对苯二甲酸类物质     

环氧聚胺——一种细胞固定化的新型交联剂

近年来随着人们对酶和微生物细胞固定化研究的逐渐深入,对固定化的各种载体材料和固定化方法也进行广泛研究。本文报道一种固定化酶的新型交联剂——环氧聚胺(Epoxy-polyamine简称E.P.A.)用于游动放线菌葡萄糖异构酶和大肠杆菌青霉素酰化酶交联固定化的研究结果。一、材料和方法 1.菌体及试剂 (1)菌体含青霉素酰化酶之大肠杆菌,由华北制药厂提供。含葡萄糖异构酶之游动放线菌,由上海新型发酵厂提供。 (2)环氧聚胺上海市化学试剂商店。     

固相酶生产核苷酸的扩大试验获得良好结果

由广东江门甘蔗化工厂、上海啤酒厂和中国科学院上海生物化学研究所组成的固相5′-磷酸二酯酶协作组,于1976年12月在江门甘化厂酿造车间核苷酸工段进行了固相酶降解核糖核酸的扩大中间试验。在几年来的小试验基础上,终于在一个月内获得良好的结果,显示了利用固相酶改革核苷酸生产工艺的优越性,为固相酶在工业生产中的应用展示了美好前景。     

标记抗生物素-生物素酶联免疫吸附试验(LABELISA)检测血清抗-HBc/IgM的研究

本文将BAS用于固相免疫吸附试验,建立LAB-ELISA抗-HBc/IgM试验方法,并与普通ELISA法进行了比较。实验表明:本法敏感性较普通ELISA高2—4倍,检出率高出后者6.8％,且具有较好的重复性。为血清抗-HBc/IgM检测提供了一种新的、切实可行的方法。本试验采用改良过碘酸盐法制备酶标记抗生物素,以含A蛋白葡萄球菌菌体亲和吸附试验制备抗-μ抗体,在稀释液中加入凝聚正常兔IgG以克服类风湿因子的干扰、考核方法的特异性采用了含A蛋白葡萄球菌菌体吸附试验及抗HBc-抑制试验。     

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

高山被孢霉产花生四烯酸发酵条件的研究

通过一株高山被孢霉M_(20)(Mortierella alpina)产花生四烯酸的摇瓶发酵研究,确定了其最佳发酵培养基组成及最适摇瓶发酵工艺条件。摇瓶实验确定的最佳培养基组成为(g/L):玉米粉水解液葡萄糖150,酵母粉15,KH_2PO_4 3.0,NaNO_3 3.0,MgSO_4·7H_2O 0.5。最佳发酵工艺条件为:初始pH6.5,装液量为50ml/500ml摇瓶,摇床转速150r/min,温度在菌体生长前三天控制在25℃培养,以后调至20℃培养。在此条件下,发酵培养被孢霉的生物量、菌体总油脂及花生四烯酸分别高达35.5g/L、13.2g/L及2.2g/L,在15L及1000L自动机械搅拌罐进行发酵试验,AA产量分别高达1.86g/L及1.70g/L。     

幽门螺杆菌液体培养工艺的研究

Hp的液体培养尤其是大规模培养仍存在许多问题,通过单因子试验统计分析。优化筛选了适于幽门螺杆菌的液体培养基和摇瓶培养条件。结果表明,在适宜的摇瓶培养条件下,Hp能够在添加β-环糊精（β-Cyclodextrin,β-CD）的布氏肉汤中很好地生长,菌体收获量达到0.6g/mL。     

大肠杆菌的直流电场刺激过程

以钛网电极和铂网电极对培养瓶中大肠杆菌生长过程进行加电刺激,研究其在直流电场作用下的生长情况,并结合循环伏安扫描、恒电流、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及测定菌体ATP酶活力等技术对大肠杆菌的直流电场刺激过程进行研究。结果表明,在0-0.2275mA/cm2范围内,随着电流密度的增加,直流电场对大肠杆菌生长量的增长促进作用逐渐增加,而0.0455mA/cm2的电场则是获得最大活菌量的最适电流密度;通过对析氢活性不同的铂网电极与钛网电极通加相同电流密度的电场,发现铂电极培养体系菌体生长优于钛电极培养体系菌体的生长。经验证发现引起这种变化的原因主要是水的阴极电解产物吸附氢和氢气比例的不同引起的;同时发现在0.091mA/cm2电流密度下,直流电场能有效提高ATP酶的活力,在8h时通电菌样酶活为不通电菌样酶活的3.2倍;通过对0.0455mA/cm2直流电场刺激后的菌体蛋白进行SDS-PAGE分析发现加电菌体在分子量25kD与35kD左右多肽表达量明显高于不加电菌体的多肽表达量,而在分子量为66.2kD左右时多肽表达量低于不加电菌体多肽表达量。     

大肠杆菌工程菌高密度发酵生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶

为提高大肠杆菌基因工程菌E.coli-p ET21a高密度培养生产L-抗坏血酸-2-葡糖苷酶产量,采用摇瓶培养的方法,通过考察培养液菌体量和酶产量,筛选适用于E.coli-p ET21a液体深层发酵的培养基。50 L发酵罐采用适用于工业化大生产的搅拌、供氧、p H控制和过程补料方式,进行液体深层发酵放大培养,大幅度提高酶产量。通过优化发酵过程控制p H和诱导温度,发酵液酶活提高至88 U/m L,达到摇瓶培养的10.1倍。研究结果对大肠杆菌基因工程菌高密度培养,高效表达生物酶有重要的参考价值。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺研究

以表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌作为出发菌株,在摇瓶培养的基础上,建立了大肠杆菌工程菌产普鲁兰酶的高密度发酵工艺。通过测定细胞密度、细胞干重、分离菌体可溶性成分与不溶性成分及SDS-PAGE电泳,分析重组大肠杆菌的生长和普鲁兰酶的表达情况。摇瓶试验使用合成培养基和LB培养基,重组大肠杆菌在合成培养基生长较慢,诱导5 h的普鲁兰酶表达量高于LB培养基,包涵体比例低于LB培养基。重组大肠杆菌的高密度发酵使用合成培养基,补料阶段采用指数流加的工艺,在设定细胞的比生长速率为0.12的前提下,限制补料中碳源的供应,以阻止乙酸的产生。当细胞密度OD600达到70.0开始诱导,最终细胞密度为每升53.3 g细胞干重,细胞内可溶性普鲁兰酶为每升1.35 g。     

用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶.方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi).用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体.通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi).在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶.用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析.结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用.结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础.     

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D-泛解酸内酯水解酶的菌株,经鉴定为串珠镶孢霉菌（Fusarium monili-forme)SW-902。产酶条件研究表明,用甘油作碳源,蛋白胨作氮源,初始pH8.0,温度26℃,摇瓶培养3d,产酶量最高,在60L发酵罐中通风发酵45h,产菌丝体生物量7.18g干菌体/L,D-泛解酸内酯水解酶酶活力达到0.92IU/g干菌体。     

不同培养条件对胶质芽孢杆菌诱导碳酸钙晶体形成的影响

【目的】研究不同培养条件对胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)菌体形态、数量和分泌的碳酸酐酶(CA酶)活性的影响,以及不同方式培养的菌体与碳酸钙晶体的生长及其形貌、数量之间的联系。【方法】分别采用无氮和有氮培养基培养胶质芽孢杆菌,进行菌体形态、数量及CA酶活性的比较,收集不同培养方式的菌体加入碳酸钙结晶体系中以研究细菌与碳酸钙晶体形成的联系。【结果】在无氮培养条件下,胶质芽孢杆菌数量少、荚膜肥厚,细菌培养液CA酶活力较低;有氮培养条件下,菌体数量多、荚膜单薄,细菌培养液CA酶活力较高。在碳酸钙结晶体系中加入无氮培养的菌体,生成的碳酸钙晶体表面光滑,体积较大但数量较小,加入有氮条件下培养的菌体形成的碳酸钙晶体表面粗糙,数量大但体积较小。【结论】不同培养条件能够引起胶质芽孢杆菌菌体数量、荚膜多糖及CA酶活的明显差异,进而对碳酸钙晶体的生成和形貌产生影响。     

Topotecan对癌细胞系SUD4和DOHH2的拓扑异构酶(Ⅰ,Ⅱ)的毒性作用

Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ（ＴＰＴ）是类似天然抗癌药物喜树碱的半合成新药．为了阐明ＴＰＴ对拓扑异构酶的毒性作用,将癌细胞系ＳＵＤ４及ＤＯＨＨ２培养在不同浓度ＴＰＴ的培养基中,分别在培养８ｈ、１８ｈ后取样进行测试．结果表明：ＴＰＴ不仅作用于拓扑酶Ⅰ,也作用于拓扑酶Ⅱ,尽管对酶Ⅱ的影响非常小．应用新的流体细胞测量仪（ＦＡＣＳ－Ｖａｎｔａｇｅ）及免疫分析法对细胞培养时间、ＴＰＴ的浓度与拓扑酶中毒程度的动力学关系进行了研究．上述研究显示ＴＰＴ能影响拓扑异构酶Ⅱ（新观点）,同时强调在抗癌化学治疗中应结合使用酶Ⅰ及酶Ⅱ抑制剂．     

分散泛菌蔗糖异构酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶产量,研究了不同信号肽及发酵条件对蔗糖异构酶在大肠杆菌中重组表达的影响。将携带天然信号肽的蔗糖异构酶基因优化后,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)构建重组表达菌株——ORI菌株,摇瓶发酵总酶活和胞外酶活分别为85 U/m L、65 U/m L。从天然信号肽开始第22位氨基酸作为成熟蛋白的起始,连接Pel B或Omp A信号肽构建P22和O22菌株,其中P22菌株发酵总酶活提高至138 U/m L,是ORI菌株总酶活的1.6倍;而O22菌株发酵总酶活和ORI菌株无明显差别。采用3.0 g/L的乳糖诱导,P22菌株的蔗糖异构酶总酶活提高至168 U/m L。在3 L发酵罐中,研究甘氨酸浓度和诱导时间对蔗糖异构酶分泌的影响,当补加0.5%甘氨酸,DCW为18 g/L(OD_(600)=30)开始诱导,P22菌株的蔗糖异构酶胞外酶活最高达1 981 U/m L,同时蔗糖异构酶总酶活达到2 640 U/m L,是已报道大肠杆菌重组表达蔗糖异构酶的最高水平。     

巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用研究

巴氏杆菌（主要是多杀性巴氏杆菌）可以引起多种动物疫病（巴氏杆菌病）,同时也引起人类感染发病。[目的] 研究巴氏杆菌糖酵解酶对宿主细胞（兔肾细胞）和两种常见分子[纤连蛋白（fibronectin,Fn）和血浆纤维蛋白溶解酶原（plasminogen,Plg）]的黏附作用。[方法] 采用原核表达系统对多杀性巴氏杆菌的糖酵解酶进行表达并纯化及制备多克隆抗体,通过菌体表面蛋白定位检测、黏附与黏附抑制等实验探究巴氏杆菌糖酵解酶的黏附作用。[结果] 菌体表面蛋白检测结果显示除烯醇化酶和丙酮酸激酶外的7个糖酵解酶在多杀性巴氏杆菌表面存在。这7个糖酵解酶均能黏附兔肾细胞,但仅有磷酸葡萄糖异构酶的多克隆抗体能对多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞产生抑制作用。Far Western blotting结果显示9个糖酵解酶均能结合宿主Fn和Plg。招募抑制实验结果显示磷酸葡萄糖异构酶、醛缩酶、磷酸甘油酸变位酶的抗体对多杀性巴氏杆菌结合Fn和Plg都有抑制作用,磷酸果糖激酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶抗体仅对多杀性巴氏杆菌结合Fn或Plg有抑制作用。[结论] 多杀性巴氏杆菌糖酵解酶成员葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶、磷酸甘油酸变位酶在多杀性巴氏杆菌黏附宿主细胞或分子过程中发挥作用。该研究的完成将加深巴氏杆菌病分子发病机制的认识,并为巴氏杆菌病的诊断标识筛选、新型疫苗创制和药物靶标筛选等提供基础数据。     

链霉菌的D-木糖异构酶

链霉菌细胞能诱导形成D-木糖异构酶。将D-木糖异构酶进行提纯,研究它的特性,发现与细菌来源的木糖异构酶基本上性质相似。试验金属离子对经过透析后的酶的活力作用,发现除Mg~(++)与Mn~(++)能恢复因透析而失去的酶的活力外,Co~(++)同样有这个作用,而且效应甚为显著。D-木糖异构酶的诱导物并非只限于其作用底物,D-核糖也同样具有诱导作用。观察了木糖异构酶在放线菌目的分布。在链丝菌属、小单孢菌属、放丝菌属及分枝杆菌属的7个种内,发现都具有木糖异构酶,但缺少木糖还原酶,说明这类微生物对木糖的最初代谢步骤是与细菌同一类型。     

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D 泛解酸内酯水解酶的菌株 ,经鉴定为串珠镶孢霉菌 (Fusariummonili forme)SW 90 2。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始pH8 0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L发酵罐中通风发酵 45h ,产菌丝体生物量 7 1 8g干菌体 L ,D 泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 92IU g干菌体