TMV复制酶基因靶向的RNA干涉载体构建

以TMV复制酶基因作为RNAi的靶向序列,应用RT－PCR法获得目的DNA序列。依据RNAi机制,以酶切后连接的方法将目的DNA序列正向、反向锚定连接到pUCCRNAi载体质粒,构建含目的序列反向重复结构的RNA干涉中间载体;反向重复结构酶切后插入含超强启动子的pC2300-35s-OCS表达载体,重组的表达载体质粒经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中,完成双元载体系统的构建。每步的重组子经特异引物PCR验证和酶切验证有相应的特异条带存在,且测序鉴定序列正确。确认成功构建了TMV复制酶基因靶向的RNAi双元载体,为RNAi技术在植物病毒病害防治中的应用奠定基础。     

RNA干涉分子机制研究进展

RNA干涉（RNA interference,RNAi）是生物体内的一种通过双链RNA(dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制.双链RNA与同源mRNA互补结合而使特定基因失活,这一过程已经在包括拟南芥、线虫和真菌等多种模式生物中得到揭示.近来研究表明,21～25 nt的小干涉RNA（small interference RNA, siRNA）可介导哺乳动物细胞特异性基因沉默.RNAi具有高效性和高度特异性,可能成为关闭基因的新技术而在基因功能研究和疾病基因治疗中发挥重要作用.     

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300 UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300 UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。     

RNA干涉的研究进展

生物体内导入双链RNA后会引起体内同源基因特异性的沉默,这种现象称为RNA干涉,本主要介绍RNA干涉的研究历史,作用机制和应用等方面的情况。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

RNA干涉及其应用前景

RNA干涉是指由特定双链RNA(dsRNA)引起的转录后基因沉默现象。研究表明,Dicer断裂dsRNA产生的小干涉RNA可以抑制哺乳动物体细胞和胚胎中的基因的表达。RdRP在扩增RNAi中起着关键性的作用,RdRP活性复制较长的触发性dsRNA或以一种非引物的方式复制短的siRNA,即以siRNA为引物的RdRP反应使靶mRNA转变为dsRNA,同时复制触发性dsRNA。所有的产物又可作为Dicer的底物,起始RdRP级联反应。本文综述了RNAi可能的作用机制,并对RNAi在分析功能基因组、药物治疗等方面的应用前景进行了展望。     

RNA干涉的最新研究进展

RNA干涉 (RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程 .它是转录后基因沉默 (PTGS)的一种 .RNAi在生物界中广泛存在 .RNAi发生过程主要分为 3个阶段 :起始阶段 ,扩增阶段 ,效应阶段 .RNAi在维持基因组稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用 .RNAi作为基因沉默的一个工具 ,已被广泛用于基因功能研究、基因治疗和新药研究与开发等方面 .     

RNA干涉及其应用的研究进展

RNA干涉是指外源dsRNA引发身体内的基因的同源序列降解．从而表现出基因转录后的沉默现象．到目前为止在真菌、拟南芥、线虫、锥虫、水螅、涡虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等真核生物中都发现存在这一基因沉默机制。研究表明,RNA干涉与植物中的共抑制、真菌中的基因压制,很可能具有共同的基本分子机制。RNA干涉可以用于功能基因组学研究．也可用于克服转基因生物的基因沉默现象,使外源基因在遗传改良生物中能更好地表达,还用于基因治疗,抑制有害基因的表达等。     

慢病毒载体介导RNAi的研究进展

RNAi通过双链RNA的介导,特异性阻抑相关序列的表达,从而导致转录后水平的基因沉默.广泛存在于真菌、植物和动物等真核生物中.慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具,被广泛应用于相关的RNAi研究领域,例如抗病毒研究、癌症及其治疗、遗传性疾病的治疗、基因治疗.现已发现,慢病毒载体能够介导组织特异、时间特异的RNAi,在疾病的基因靶向性治疗上必有广阔的前景.     

多靶向RNA干扰技术在基因治疗中的应用与前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)通过转录后基因沉默效应特异性抑制靶基因的表达,其沉默机制的高效性、特异性及稳定性使这项技术成为生物医学领域研究基因治疗的重要工具。阐述RNAi技术的特点和RNAi疗法的现状,特别是多靶小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)目前的发展态势及其各种结构性修饰,通过使用这些结构修饰的siRNA提高基因沉默的效率,将有助于提高疗效。但该技术在广泛应用于临床之前,仍存在一些亟待解决的问题与面临的挑战,需进一步研究。     

RNAi Transfection Results in Lipidome Changes

RNAi experiments are ubiquitously used in cell biology and are achieved by transfection of small interfering RNAs (siRNAs) into cells using a transfection reagent. These results in knock‐down of proteins of interest, and the phenotypic consequences are then analyzed. It is reported here that two common RNA interference (RNAi) transfection reagents, DharmaFECT 1 and INTERFERin, in mock transfections using non‐targeting siRNAs, cause alterations in the lipidome of HeLa cells. Some lipids change in response to both, presumably chemically different, transfection reagents, while other lipid species change only in response to one of the reagents. While the functional implications of these lipidomic alterations remain to be investigated, the authors' experiments suggest that it is important to use appropriate mock transfection controls during RNAi experiments, ideally complemented by an orthogonal perturbation, especially when investigating membrane‐associated phenomena.     

Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染H9c2细胞系的构建

运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒,经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞,通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系,最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定,通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此,本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系,为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。     

表达siRNA的重组腺相关病毒载体的构建和鉴定

腺相关病毒(AAV)载体介导的RNA干扰(RNAi)可在哺乳动物细胞中长期特异性抑制同源基因表达。本研究以AAV Helper-Free System中的转移质粒pAAV-MCS为基础,引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和H1启动子,将该质粒改造为可表达小干扰RNA(siRNA)和EGFP的质粒pAAV-EGFP-H1。该质粒与辅助质粒共转染包装细胞后,获得了具有感染性的重组AAV(rAAV)。以EGFP为靶基因的干扰实验证明:所得rAAV可以产生siRNA并能够特异性抑制EGFP靶基因表达;荧光显微镜观察、FACS分析和Real-time PCR方法均表明重组病毒rAAV-H1-sh EGFP引起EGFP的表达降低大于60%。     

鸡源细胞基因沉默及快速筛选的实用型双标记RNAi载体

利用人H1 RNA启动子、EGFP基因及Neomycin抗性基因,构建用于禽类细胞基因持续沉默和快速筛选的实用型RNAi载体。在将pCDNA3.1(+)载体上的SV40启动子替换为鸡源的β-actin启动子后,装入EGFP基因表达框以及用于驱动外源shRNA转录的人H1 RNA启动子,构建成同时具有EGFP和Neomycin抗性双标记的RNAi载体,并为载体引入独特设计的含媒介序列的多克隆位点以方便外源shRNA编码小片断插入后的快速筛选,载体设计非常实用。插入靶向EGFP和sIgM λ基因的shRNA编码序列后分别瞬时转染DF-1和DT40细胞,结果显示靶基因表达得到了明显抑制。联用EGFP和Neomycin双标记快速筛选sIgM λ轻链基因稳定沉默的DT40细胞克隆的结果也证实,H1启动子转录shRNA的干扰效果是高效的,双标记筛选策略不仅有效而且方便、快捷。     

An Altered Method of Feeding RNAi That Knocks Down Multiple Genes Simultaneously in the Nematode Caenorhabditis elegans

In reverse genetics, RNA interference (RNAi) which is substitutable for gene-disruption, is an outstanding method for knockdown of a gene’s function. In Caenorhabditis elegans, feeding RNAi is most convenient, but this RNAi is not suitable for knockdown of multiple genes. Hence, we attempted to establish an efficient method of feeding RNAi for multiple knockdown. We produced bacteria yielding three distinct double-stranded RNAs bound to one another, and fed those bacteria to C. elegans. Quantitative RT-PCR and observation of phenotypes indicated that our method is much more efficient than the traditional one. Our method is useful for investigating genes’ functions in C. elegans.     

转基因RNAi技术在动物抗病毒育种中的应用

病毒对动物和人类健康都是极大的威胁,抗病毒疫苗虽然能在一定程度上预防病毒病,但目前几乎还不能对变异的传染病进行抗病毒治疗。尽管RNA干扰研究到目前才短短十几年,其作用机理已基本清楚。RNAi能够非常有效的抑制病毒体内复制,其介导的抗病转基因动物的研究相继取得了阶段性进展,抗疯牛病转基因羊和牛,抗内源性逆转录病毒猪以及抗核型多角体病毒病的转基因家蚕已经成功获得。尽管如此,目前的研究主要还是集中在细胞水平及小鼠模型方面,获得的转基因动物种类和数量有限,但为培育动物抗病毒品种提供了理论依据和技术支撑。随着转基因技术的不断的进步和成熟, RNA干扰技术将成为动物抗病毒育种中最有应用前景的方法之一。     

RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指外源或内源的双链RNA（dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象,它作为一种有效的工具用来产生转录后沉默,从而抑制特定基因的表达,成为基因功能研究的一种新方法,除了在模式昆虫如果蝇Drosophila中广泛应用之外,也在非模式昆虫中得到成功应用。近年来,RNAi技术在导入方法和基因功能分析方面都取得了飞速发展,且与转基因技术相结合成功应用于害虫防治领域。本文综述了RNAi技术在导入方法、昆虫功能基因组功能分析及害虫防治等领域新近的研究成果,并展望了该技术的应用前景。