中国林蛙和中华蟾蜍皮肤抗菌肽的分离纯化及其抗菌活性

分别以中国林蛙长白山亚种Rana chensinensis changbaishansis和中华蟾蜍Bufo gargarizans的鲜皮为原料,通过酸化乙醇法提取抗菌肽粗提液,再经葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化获得抗菌肽纯品,采用滤纸片法进行抑菌活性研究.结果 表明,经Sephadex G-50和Sephadex G-100分离纯化后获得3种多肽,中国林蛙与中华蟾蜍皮肤中的活性多肽对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都具有一定的抗菌作用,其中多肽Ⅲ具有最佳的抑菌效果.抗菌肽相对含量比较的结果表明,蟾蜍皮肤中抗菌活性肽的含量较高,是理想的抗菌肽提出和纯化的源材料.     

光滑鳖甲抗菌肽的原核表达条件优化及其抗菌活性

【目的】本研究旨在探索光滑鳖甲Anatolica polita borealis抗菌肽Ap AMP1015的最佳原核表达条件及其抗菌活性。【方法】利用生物信息学方法对得到的Ap AMP1015基因序列和蛋白结构进行分析,运用原核表达技术表达Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,通过Western blot方法鉴定蛋白,并利用亲和层析的方法获得纯化的Trx A-Ap AMP1015融合蛋白,抑菌圈实验验证蛋白抗菌活性。【结果】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,其开放阅读框长387 bp,编码128个氨基酸,其中包含由19个氨基酸组成的信号肽和75个氨基酸组成的成熟肽。NCBI数据库同源序列比对结果显示该蛋白属Coleoptericin抗菌肽家族。确定了蛋白表达的最佳条件:0.1 mmol/L IPTG 150 r/min 25℃诱导4 h。肠激酶切割后的Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌Escherichia coli的生长。【结论】克隆得到光滑鳖甲抗菌肽基因Ap AMP1015,获得了其编码蛋白的最优表达条件,研究发现Ap AMP1015能够有效抑制大肠杆菌的生长。本研究为光滑鳖甲抗菌肽Ap AMP1015的应用和进一步研究奠定了基础。     

黄粉虫抗茵肽TmAMP3在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

昆虫抗菌肽具有广谱抗菌活性,克隆黄粉虫Tenebrio molitor抗菌肽基因,进行原核表达和活性检测,为昆虫抗菌肽推广应用奠定一定基础.根据GenBank公布的黄粉虫抗菌肽序列设计特异引物,以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因TmAMP3,将其亚克隆至pET-30a表达载体中,转化到大肠杆菌Escheric...     

中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆及抗菌、抗癌和溶血活性的测定

采用RT-PCR和3￠RACE方法, 从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同抗菌肽前体的cDNA序列, 分别命名为: preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。cDNA碱基序列全长为289~315 bp, 编码59~65个氨基酸。6个抗菌肽前体由3部分结构域组成: 22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体, 具有肽链短, C-端酰胺化的特点; preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体, 在肽链的C-端含有RANA盒结构, 可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键, 组成7肽环; preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽, 被鉴定为新抗菌肽。人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤抗菌肽, 活性检测结果表明: 它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用, 同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。     

β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

为了研究抗菌肽β-防御素130的生物学活性和实现大规模制备,通过改良其分子结构,构建表达载体pET28a-3×β-defensin130,利用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主细胞诱导表达后为水溶性蛋白。对纯化后抗菌肽进行抑菌实验、稳定性实验、MTT实验和溶血性实验确定其生物活性。最终成功制备出25 kDa的重组蛋白,对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(45μg/mL)和单增李斯特菌(ATCC221633)(80μg/mL)等革兰氏阴性和阳性菌都表现出极强的抗菌活性,且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化等影响,MTT细胞毒性实验显示其对HEK293细胞无毒性且对兔源红细胞具有极低的溶血性。这将为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。     

直链烷基苯磺酸钠对中国林蛙抗菌肽基因表达的影响

近年来由于生境丧失及环境污染等原因,中国林蛙野生种群急剧减少.为深入研究水体中普遍存在的阴离子表面活性剂直链烷基苯磺酸钠(linear alkylbenzene sulfonate,LAS)对中国林蛙生存的影响,通过急毒实验确定LAS对分别处于发育阶段26、32、42、46期的中国林蛙的半致死浓度.同时利用1、4、8 mg/L LAS处理不同发育阶段中国林蛙,研究LAS对中国林蛙存活率、发育状态的影响,并利用real-time PCR技术检测中国林蛙抗菌肽基因表达水平变化.结果表明,当处理时间为96 h,LAS浓度达到12.33 mg/L以上时会对不同发育阶段中国林蛙产生较为严重的致死效应.1~8 mg/L浓度范围的LAS虽然对中国林蛙存活和发育没有明显影响,但是改变了其抗菌肽基因表达模式.特别是中国林蛙胚后发育后期(32期)和变态期(42期),4~8 mg/L LAS会在不同程度上抑制prepropalustrin-2CE3、preprobrevinin-2CE1和preprotemporin-1CEd1抗菌肽基因表达.总体而言,高浓度LAS对中国林蛙免疫系统造成一定影响,可能使该物种更易受到致病菌的侵袭.研究结果为化学污染物对中国林蛙免疫系统影响积累了实验数据,同时为研究中国林蛙抗菌肽基因表达的调控通路提供一定的理论依据.     

Affinity purification of fibrinogen using a ligand from a peptide library.

An affinity resin containing the peptide ligand Phe-Leu-Leu-Val-Pro-Leu (FLLVPL) has been developed for the purification of fibrinogen. The ligand was identified by screening a solid-phase combinatorial peptide library using an immunostaining technique. The specific binding of fibrinogen to the ligand has been characterized by isothermal calorimetry and adsorption isotherms and is dominated by both hydrophobic interactions and ionic interactions with the N-terminal free amino group. The effective association constant of fibrinogen was substantially higher when the peptide was immobilized on the resin than in solution; moreover, it increased with increasing peptide density, suggesting a cooperative binding effect. A low ionic strength buffer at pH 4 was used successfully to elute adsorbed fibrinogen from the column with high purity, retention of factor XIII crosslinking activity, and minimal, if any, loss of biological function. This general approach to ligand selection and characterization can be used to develop peptide ligands for the affinity purification of diverse proteins on a large scale.     

黄粉虫抗菌肽Tenecin蛋白的纯化及其抑菌活性研究

目的 纯化黄粉虫抗菌肽Tenecin蛋白,并检测其抑菌活性.方法用1 mmol/L IPTG大量诱导表达Tenecin蛋白,纯化后检测其抑菌活性,包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 29213,大肠埃希菌（Escherichia coli）ATCC 25922,白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231和痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）CMCC 51252等4种标准菌.结果 SDS-PAGE电泳检测表明已获得纯化的Tenecin蛋白;体外抑菌试验结果表明,浓度为120、60、30、15 μg/ml的Tenecin与4种标准菌共培养18 h后,对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,而对白色念珠菌的抑制作用最弱.对同一菌种而言,浓度为60和30 μg/ml两组间无统计学意义（P＞0.05）,而其他各浓度的组间均有显著性差异（P＜0.01）;对同一浓度的Tenecin而言,其对白色念珠菌和痢疾志贺氏菌的抑菌效果组间无统计学意义（P＞0.05）,其余各组之间均有显著性差异（P＜0.01）.结论 获得的Tenecin蛋白可明显抑制病原菌,为进一步研究其抑菌机理和后期研发奠定了基础.     

内芽孢杆菌属细菌(Paenibacillus daejeonensis)SS02抗菌蛋白的分离纯化和其性质的研究

内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeoneusis）SS02,是一株能强烈抑制玉米纹枯菌（Rhizoctonia cerealis）、白色念珠菌（Candidal vaginitis）等病害真菌的拮抗菌株。SS02菌株培养液经硫酸铵分级盐析,SephadexG-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白,命名为SD22。蛋白电泳分析结果表明,此蛋白分子量为56000,等电点为6．4。此蛋白对热和紫外线稳定,对蛋白酶部分敏感。纯化后的SD22对玉米纹枯菌（Rhizoctonia cerealis）、油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricala）、绿色木霉（Triclwdema viride）、绿色粘帚霉（Gliocladium viride）、弯孢霉菌（Curvula rialeafspot）、镰刀霉菌（Fusarium sp．）、赤霉菌（Fusarium headblight）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌（Candidal vaginitis）、冬瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum Schl．emend,Snyder＆Hause）等菌有很强的抑制作用。     

九香虫抗菌肽CcAMP1的分离纯化和抗菌活性检测

【目的】从药用昆虫九香虫 Coridius chinensis 中分离纯化抗菌肽,为进一步开发九香虫抗菌肽资源及深入挖掘九香虫的药用功能奠定基础。【方法】用大肠杆菌Escherichia coli 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 混合物作诱导源刺激九香虫产生抗菌肽,对血淋巴进行提取、凝胶过滤层析、固相萃取及反相色谱纯化,活性组分经质谱测定。对分离得到的这种抗菌肽进行人工合成,并进行抗菌活性检测。【结果】本研究获得一种九香虫抗菌肽CcAMP1,由17个氨基酸残基组成,分子量为1 997.37 u,带1个正电荷,表面有5个疏水氨基酸。对人工合成的CcAMP1进行抗菌活性检测表明,该抗菌肽与九香虫血淋巴一样对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌等革兰氏阴性菌都有较好的抗菌活性,且对革兰氏阴性菌的抗菌活性更强。【结论】从九香虫中分离得到具有较强抗菌活性的阳离子抗菌肽CcAMP1,有较大的开发利用价值。     

内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeonensis）SS02抗菌蛋白的分离纯化和其性质的研究

内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeonensis）SS02,是一株能强烈抑制玉米纹枯菌（Rhizoctonia cerealis）、白色念珠菌 (Candidal vaginitis)等病害真菌的拮抗菌株。SS02菌株培养液经硫酸铵分级盐析,Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白,命名为SD22。蛋白电泳分析结果表明,此蛋白分子量为56000,等电点为6.4。此蛋白对热和紫外线稳定,对蛋白酶部分敏感。纯化后的SD22对玉米纹枯菌(Rhizoctonia cerealis)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、苹果轮纹病菌（Physalospora piricala）、绿色木霉(Trichodema viride)、绿色粘帚霉（Gliocladium viride）、弯孢霉菌(Curvularia leaf spot)、镰刀霉菌(Fusarium sp.)、赤霉菌(Fusarium head blight)、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌(Candidal vaginitis）、冬瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum Schl.emend.Snyder & Hanse）等菌有很强的抑制作用。     

内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeonensis）SS02抗菌蛋白的分离纯化和其性质的研究

内芽孢杆菌属细菌（Paenibacillus daejeonensis）SS02,是一株能强烈抑制玉米纹枯菌（Rhizoctonia cerealis）、白色念珠菌 (Candidal vaginitis)等病害真菌的拮抗菌株。SS02菌株培养液经硫酸铵分级盐析,Sephadex G-75凝胶柱层析和DEAE-32纤维素柱层析分离纯化出一种抗菌蛋白,命名为SD22。蛋白电泳分析结果表明,此蛋白分子量为56000,等电点为6.4。此蛋白对热和紫外线稳定,对蛋白酶部分敏感。纯化后的SD22对玉米纹枯菌(Rhizoctonia cerealis)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、苹果轮纹病菌（Physalospora piricala）、绿色木霉(Trichodema viride)、绿色粘帚霉（Gliocladium viride）、弯孢霉菌(Curvularia leaf spot)、镰刀霉菌(Fusarium sp.)、赤霉菌(Fusarium head blight)、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylo-coccus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌(Candidal vaginitis）、冬瓜枯萎菌（Fusarium oxysporum Schl.emend.Snyder & Hanse）等菌有很强的抑制作用。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

Integrated tandem affinity protein purification using the polyhistidine plus extra 4 amino acids (HiP4) tag system

Peptide tag systems are a robust biophysical and biochemical method that is widely used for protein detection and purification. Here, we developed a novel tag system termed “HiP4” (histidine plus four amino acids) whose epitope sequence comprises only seven amino acids (HHHDYDI) that partially overlap with the conventional 6x histidine tag (6xHis-tag). We produced a monoclonal antibody against the HiP4 tag that can be used in multiple immunoassays with high specificity and affinity. Using this system, we developed a tandem affinity purification (TAP) and mass spectrometry (TAP-MS) system for comprehensive protein interactome analysis. The integrated use of nickel bead purification followed by HiP4 tag immunoprecipitation made it possible to reduce nonspecific binding and improve selectivity, leading to the recovery of previously unrecognized proteins that interact with hepatitis B virus X (HBx) protein or TAR DNA-binding protein 43 (TARDBP or TDP-43). Our results indicate that this system may be viable as a simple and powerful tool for TAP-MS that can achieve low background and high selectivity in comprehensive protein–protein interaction analyses.     

Purification of a novel antibacterial short peptide in earthworm Eisenia foetida

Earthworms live in an environment with abundantpathogens. These pathogens are, firstly, bacteria living inwater or soil that are ingested during feeding or introducedinto the body following injury. Parasites, particularlylarval forms, which represent the dissemination phase,are another important group of potentially pathogenicagents. During the course of evolution, earthworms havedeveloped defense strategies against these living patho-gens [1,2]. Earthworms lack true antibodies and hence anada…     

利用ELP-Intein系统在大肠杆菌中生产抗菌肽DLP4

DLP4 （defensin-like peptide 4）是一种新型昆虫防御素抗菌肽,对革兰氏阳性细菌具有强大的抗菌活性而且不易产生抗药性。本研究利用类弹性蛋白（elastin-like polypeptide, ELP）的相变特性和蛋白质内含子（intein, I）的C端断裂系统,通过构建重组表达质粒pET-ELP-I-DLP4,以大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主细胞,诱导表达后的重组蛋白通过简单的离心、pH和温度转变进行纯化得到DLP4。研究中发现,在表达纯化过程中蛋白质内含子发生了C端提前断裂。为了解决这一问题,将其断裂为N端片段（I0_N）和C端片段（I0_C）后,分别与ELP或DLP4融合,构建了pET-ELP-I0_N和pET-ELP-I0_C-DLP4两种重组表达质粒。分别在大肠杆菌中诱导表达,将表达后的菌液混合,使蛋白质内含子恢复C端断裂活性,最终得到的DLP4的得率约为1.49 mg/L。抑菌试验证明纯化的DLP4表现出预期活性,这为DLP4在原核系统中的表达纯化提供...     

黄粉虫抗菌肽的提取及其生化特性的研究

【目的】测定黄粉虫Tenebrio molitor Linnaeus幼虫抗菌肽提取液的浓度、抑菌活性及其部分生化特性和凝血效应。【方法】本实验用浓度为1×108 CFU/m L大肠杆菌Escherichia coli诱导5龄黄粉虫幼虫,分别在诱导12、24、36、48、60和72 h后提取其中的抗菌肽,并用考马斯亮兰法测定抗菌肽粗提液蛋白的浓度,并用滤纸片法测定其抑菌活性,同时对其热稳定性、反复冻融稳定性、蛋白酶稳定性及不同p H对其活性的影响等生化特性及凝血效应进行了探究。【结果】经大肠杆菌诱导的黄粉虫抗菌肽粗提液的蛋白浓度均显著高于未诱导的黄粉虫组(P<0.01),且在诱导48 h时产生的抗菌肽提取液蛋白的浓度最高,产生的抑菌圈直径也显著高于未诱导的黄粉虫组(P<0.05),生化特性的测定结果显示,黄粉虫抗菌肽有较好的热稳定性、酶稳定性及酸碱稳定性,反复冻溶后对其抑菌活性影响不大,并且无凝血效应。【结论】大肠杆菌可以刺激黄粉虫的免疫系统,增加抗菌肽的表达量,使其产生浓度高、活性强的抗菌肽,且生化特性较稳定。本研究对黄粉虫抗菌肽作为绿色抗生素用于畜牧养殖业的进一步开发与利用提供了科学的理论依据。     

Purification of a peptide tagged protein via an affinity chromatographic process with underivatized silica

Silica is widely used for chromatography resins due to its high mechanical strength, column efficiency, easy manufacturing (i.e. controlled size and porosity), and low‐cost. Despite these positive attributes to silica, it is currently used as a backbone for chromatographic resins in biotechnological downstream processing. The aim of this study is to show how the octapeptide (RH)4 can be used as peptide tag for high‐purity protein purification on bare silica. The tag possesses a high affinity to deprotonated silanol groups because the tag''s arginine groups interact with the surface via an ion pairing mechanism. A chromatographic workflow to purify GFP fused with (RH)4 could be implemented. Purities were determined by SDS‐PAGE and RP‐HPLC. The equilibrium binding capacity of the fusion protein GFP‐(RH)4 on silica is 450 mg/g and the dynamic binding capacity around 3 mg/mL. One‐step purification from clarified lysate achieved a purity of 93% and a recovery of 94%. Overloading the column enhances the purity to >95%. Static experiments with different buffers showed variability of the method making the system independent from buffer choice. Our designed peptide tag allows bare silica to be utilized in preparative chromatography for downstream bioprocessing; thus, providing a cost saving factor regarding expensive surface functionalization. Underivatized silica in combination with our (RH)4 peptide tag allows the purification of proteins, in all scales, without relying on complex resins.     

Effects of IMAC specific peptide tags on the stability of recombinant green fluorescent protein

Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) using peptide affinity tags has become a popular tool for protein purification. An important feature dictating the use of a specific affinity tag is whether its structure influences the properties of the target protein to which it is attached. In this work we have studied the influence on protein stability of two novel peptide affinity tags, namely NT1A and HIT2, and compared their effect to the commonly used hexa‐histidine tag, all attached to the C‐terminus of a enhanced green fluorescent protein (eGFP). A comparison of the influence of C‐ or N‐terminal orientation of the tags was also carried out by studying the NT1A tag attached at either terminus of the eGFP. Protein stability was studied utilising guanidine hydrochloride equilibrium unfolding procedures and CD and fluorescence spectroscopy. The novel peptide affinity tags, NT1A and HIT2, and the His₆ tag were found to not affect the stability of eGFP. Although these results are protein specific, they highlight, nevertheless, the need to employ suitable characterisation tools if the impact of a specific peptide tag on the folded status or stability of a recombinant tagged protein, purified by immobilized metal ion affinity chromatographic methods, are to be rigorously evaluated and the appropriate choice of peptide tag made. © 2011 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 2011     

从Granulysin抗菌机理出发合理设计抗菌肽

Granulysin是一种表达于人体毒性T淋巴细胞中的抗菌蛋白,其作用相当于广谱抗菌素。随着分子模拟技术的发展,人们已经初步掌握了其结构与功能的关系,有关这方面的研究也取得了较大的进展。根据Granulysin的覆膜作用机理重新设计出具有活性的抗菌小肽,并通过实验对该片段的活性进行检验。