基于痘苗病毒载体的恶性肿瘤基因治疗研究进展

基因治疗一直是肿瘤生物治疗的重要策略,而以溶瘤痘苗病毒为载体的肿瘤治疗近年来受到较多关注。该文总结了目前用于恶性肿瘤治疗的痘苗病毒和基于痘苗病毒载体的基因治疗研究进展及其在各个领域的成果。     

病毒载体与造血干细胞基因治疗

多种获得性和遗传性疾病累及造血细胞。造血干细胞是人类基因治疗的重要靶细胞。成功的造血干细胞基因治疗不仅需要高效基因转移,还需要治疗基因的长期、高水平表达。反转录病毒载体是造血干细胞基因治疗的常用载体,结合优化的造血干细胞转导条件,其介导的腺苷脱氨酶缺陷引起的严重联合免疫缺陷和X染色体连锁的严重联合免疫缺陷的基因治疗已经获得初步成功;其他整合型病毒载体如慢病毒和腺相关病毒载体,也在临床前造血干细胞基因治疗研究中得到广泛应用。从病毒载体、基因转移和基因表达等几个方面综述了造血干细胞基因治疗的临床前和临床研究的重要进展。     

痘苗病毒载体的特点及应用

痘苗病毒具有宿主范围广,安全,高效表达,插入外源基因的容量大等诸钦优点,是继反转录病毒,腺病毒载体之后又一广泛应用的载体系统。本文对痘苗病毒载体的特点及其应用作了综述。     

基因治疗的病毒载体系统

病毒载体是基因治疗中应用最为广泛的载体系统。该文就RNA病毒载体、DNA病毒载体和杂合病毒载体的生物学特性、基因组特点以及其在基因治疗中的优缺点进行综述,并对病毒载体系统的发展前景进行了展望。     

腺病毒及腺病毒相关病毒载体与基因治疗

腺病毒及腺病毒相关病毒能感染增殖与静止的细胞,宿主范围广,其稳定,安全滴度高,转染效率高,腺病毒载体能承载较大的外源基因,腺病毒相关病毒载体能定向整合入靶细胞基因组内等特点,使腺病毒及腺病毒相关病毒载体成为体内用于基因治疗的理想运载系统。     

腺相关病毒载体基因治疗的研究进展

腺相关病毒 (ＡＡＶ)属于病毒中最小、也是最简单的一种———细小病毒属 ,它是一种有缺陷的非致病性的人类细小病毒 ,重组的腺相关病毒 (ｒＡＡＶ)作为基因治疗的载体 ,对长期基因矫正和基因治疗具有优越性。新的生产工艺提高了ｒＡＡＶ的滴度 ,去除了腺病毒的污染 ,并构建了适用于不同靶细胞的可诱导载体。这些改进有望加速进一步的动物实验研究 ,使临床治疗人类疾病早日成为可能。1 .ｒＡＡＶ的制备方法在 1 989年 ,首次产生了没有野生型ＡＡＶ帮助复制的重组的ＡＡＶ ,这以后 ,为了增加病毒颗粒数 ,人们制造了许多ＡＡＶ辅助质粒 ,其中…     

基因治疗中的动物病毒载体

动物病毒载体在基因转移和治疗中有着重要意义。逆转录病毒载体是目前用子基因治疗最为成功的,已用于多种病例的临床研究;腺病毒载体成功地对多种基因进行了转移,并用于囊性纤维病的基因治疗临床研究;腺病毒相关病毒载体和单纯疤疾病毒载体介导的基因转移在体外培养细胞和动物实验中都取得成功,在某些疾病的基因治疗中显示出特殊的应用价值。     

腺相关病毒载体与中枢神经系统的基因治疗

本文对ＡＡＶ的分子生物学结构,重组和其对细胞的整合及ｒＡＡＶ载体在基因治疗中的作用,尤其是ｒＡＡ载体在中枢神经系统疾病基因方面的最新应用作了较全面阐述。     

重组痘苗狂犬病毒糖蛋白的构建、表达及其遗传稳定性研究

狂犬病毒糖蛋白基因的痘苗病毒表达质粒 pWS 4在鸡胚细胞内与野生型痘苗病毒天坛株 (痘苗病毒 )同源重组 ,经蚀斑纯化 ,获得表达狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒 (重组病毒 )。该重组病毒DNAdotblot显示强阳性信号 ,间接免疫荧光试验胞膜及胞浆均见到强阳性荧光反应 ,Westernblot分析仅在 6 4ku处呈现一条狂犬病毒非融合性糖蛋白带。免疫小鼠和狗 ,第 2 8d抗狂犬病毒中和抗体滴度分别达 2 4 30和 >6 96。初免后 14d用 5 0～ 10 0LD50 狂犬病毒CVS株对小鼠脑内攻击 ,保护率达 80 %以上。致病性明显减弱。从第 11代起连续传至 30代 ,病毒纯度、病毒滴度、血凝滴度、蛋白的表达、抗原活性和保护性均无差异 ,说明该重组病毒有良好的遗传稳定性。     

痘苗病毒的复制与中间纤维的关系

应用细胞选择性抽提与核酸点杂交技术业示,痘苗病毒的DNA 存在于中间纤维-核纤层-核基质组分(IF-L-NM)中。进而用DGD包埋-去包埋和电镜放射自显影技术相结合,结果表明新合成的病毒的DNA 优先结合在中间纤维上。在此基础上采用DNA 与蛋白质的体外吸附杂交实验,进一步说明痘苗病毒DNA序列与中间纤维及某些核基质蛋白质有较高的亲和性。     

汉滩病毒糖蛋白G1G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

以汉滩病毒７６／１１８株Ｍ、Ｓ片段分别插入转南粒ＰＪＳＢ１１７５的Ｐ１１和Ｐ７．５启动子下游,构建成重组质粒ＰＪＳＢ１１７．５Ｓ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染针重组质粒分别与痘苗病毒天坛株ＴＫｖｖ和表达Ｓ片的重线痘苗病毒ＶＪＳＡ１１７５Ｓ进行共转染,免疫酶斑和蓝白筛法筛选并纯化,得到了重组病毒ＶＪＳＢ１１Ｍ５Ｓ。Ｂｕｄｒ的选择压力试验表明,外源基因确定插入在ＴＫ基因区;ＰＣＲ及打点杂交证实了两个片     

麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表达

将麻疹病毒F和HA基因插入到痘苗病毒中,分别处于痘苗启动子P7.5与P11控制下,获得重组病毒vLmF和vCmH。用抗F多肽抗体和HA单抗进行ELISA检测,结果表明,两株重组病毒均能表达相应的麻疹蛋白。蛋白印迹显示重组病毒表达产物在分子大小,蛋白切割和糖化方面与麻疹病毒糖蛋白一致。两株重组病毒分别免疫家兔都能产生较高滴度的麻疹抗体,这些抗体具有中和作用和血溶抑制作用。此外,vCmH产生的抗体还具有血凝抑制作用。     

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２的基因,分别克隆到具有７．５ｋ启动子的痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ５上;将ＣＶＢ３衣壳蛋白全基因克隆到具有Ｔ７启动子的痘苗表达载体ｐＴＭ１上,并筛先到相应的重组痘苗病毒ＶＶＰ１、ＶＶＰ２和ＶＶＰ／４／２／３／１。ＶＶＰ１和ＶＶＰ２稳定表达产物为ＣＶＢ３衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２,而ＶＶＰ４／２／３／１为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性     

表达人GM—CSF重组痘苗病毒抗肿瘤作用的实验研究

将ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ插入含有Ｐ１１ｋ及２５ｋ双向启动子的痘苗病毒载体ＰＪ１２０的Ｐ１１Ｋ启动子下游,而Ｐ２５Ｋ下游则为ＬａｃＺ基因,成表达质粒ｐＪ１２０／ＧＭ－ＣＳＦ。,以此质粒与痘苗病毒天坛株共转染ＴＫ－１４３细胞。在ＢＵdisplay status     

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。