大肠杆菌aroG基因的克隆表达及与pheA、tyrB基因的串联表达

３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ）是苯丙氨酸合成途径中关键酶之一,在大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码。本文用ＮＴＧ诱变得到对苯丙氨酸类似物间氟苯丙氨酸（ｍＦＰ）和对氟苯丙氨酸（ｐＦＰ）有抗性的大肠杆菌突变株,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到了ａｒｏＧ基因,在大肠杆菌中进行了表达。结果表明,该基因能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下得到表达,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳图上出现清晰的条带,酶的比活提高了１．７倍。在ｐｈｅＡ（编码分枝酸变位酶ＣＭ和预苯酸脱水酶ＰＤ）、ｔｙｒＢ（编码苯丙氨酸转氨酶ＰＡＴ）基因克隆、串联克隆和表达完成的基础上,将ａｒｏＧ基因和ｐｈｅＡ、ｔｙｒＢ基因以ａｒｏＧ－ｐｈｅＡ－ｔｙｒＢ的顺序三基因串联到表达载体进行表达,酶活测定结果表明,三个基因都能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下表达,与对照菌株相比,酶比活分别提高了１．７倍、１３．９／７．８倍和２．３倍。     

大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达

ａｒｏＧ基因编码的 ３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ　Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ＤＳ）和 ｐｈｅＡ基因编码的分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（Ｃｈｏｒｉｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ,ＣＷ／ＰＤ）都是本丙氨酸合成途径中的关键酶,为了通过基因工程手段来增加本丙氨酸生物的产量,在利用高效的原核表达载体ｐＢＶ２２ ０对ｐｈｅＡ基因编码的ＣＭ／ ＰＤ 酶进行了表达的基础上,采用ＰＣＲ方法扩增了抗反馈抑制的ａｒｃＧ基因,进行克隆表达,并与ｐｈｅＡ基因串联,以ＰＲＰＬ－ａｒｏＧ－ＰＬ－ｐｈｅＡ的形式,实现了２种酶基因在大肠杆菌中的表达, ＳＤＳＰＡＧＥ 图谱显示了新增的４３ｋｕ及３５ｋｕ蛋白带,经酶活性测定ＤＳ、ＣＭ／ＰＤ酶的比活分别提高了 ４．６７倍、８０５／１０．７１倍。     

大肠杆菌aroG基因的克隆表达及与pheA,tyrB基因的？…

３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ）是苯丙氨酸合成途径中关键酶之一,在大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码。本文用ＮＴＧ诱变得到对苯丙氨酸类似物间氟苯丙氨酸（ｍＦＰ）和对氟苯丙氨酸（ｐＦＰ）有抗性的大肠杆菌突变株,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到了ａｒｏＧ基因,在大肠杆菌中进行了表达。结果表明,该基因能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下得到表达,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳图上出现清晰的条带     

大肠杆菌AroG蛋白F209S突变体对苯丙氨酸反馈抑制作？…

在大肠杆菌中,８０％的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯－庚酮－７－磷酸（３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏ－ｈｅｐｔｕｌｏｓｏａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ,ＤＡＨＰ）合酶由ａｒｏ基因编码。分别以大肠杆菌Ｋ１２及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总ＤＮＡ为模板,以ＰＣＲ方法扩增得到ａｒｏＧ基因及其突变。基因测序结果表明抗苯丙氨酸灯似物的突变体,其ａｒｏＧ基因核苷酸６２５位发生了Ｔ→Ｃ的点突变,从而使ＡｒｏＧ蛋白的２０     

大肠杆菌苯丙氨酸合成途径关键酶基因pheA的克隆与表达

为了通过基因工程手段来增加苯丙氨酸的生物产量,利用ＰＣＲ方法从大肠杆菌中克隆了抗反馈抑制突变型及野生型的ｐｈｅＡ基因,进行了核苷酸序列分析,并利用高效的原核表达载体ＰＢＶ２２０对ｐｈｅＡ基因编码的突变型及野生型分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（ＣＭ／ＰＤ）进行了表达。序列分析表明突变型基因碱基第５８０位由Ｔ变为Ｃ,相应氨基酸由Ｖａｌ变为Ａｌａ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱扫描分析表明目的蛋白ＣＭ／ＰＤ的表达量占全菌体蛋白的４３％,占上清总蛋白的５７％。酶活性测定表明其ＣＭ和 ＰＤ活性分别提高了 １５．５和６．７倍,产酸量也有了一定的提高,为构建产苯丙氨酸的生物工程菌奠定了基础。     

植物中合成蔗糖和淀粉的关键酶Ⅰ.腺苷二磷酸—葡萄糖焦磷酸化酶

植物中合成蔗糖和淀粉的关键酶Ⅰ．腺苷二磷酸┐葡萄糖焦磷酸化酶高振宇黄大年（中国水稻研究所,杭州３１０００６）关键词ＡＧＰＡＤＰＧ３－ＰＧＡ变构调节基因调控自本世纪８０年代初提出腺苷二磷酸（ＡＤＰ）－葡萄糖焦磷酸化酶（ＡＧＰ）是淀粉合成的中心酶以来,该...     

β—环糊精对苯丙氨酸解氨酶反应影响的研究

在含有较高浓度底物反式肉桂酸（ｔｒａｎｓ－ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ,ＣＡ）和氨反应介质中,研究了β－环糊精（β－ＣＤ）对红醇母苯丙氨酸解氨酶（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ,ＰＡＬ,ＥＣ４．３．１．５）催化反应的影响。加入适量β－ＣＤ可以克服高浓度ＣＡ对ＰＡＬ活性的抑制作用,显著增加产物Ｌ－苯丙氨酸（Ｌ－ｐｈｅ）的产量,β－ＣＤ最适用量随ＣＡ浓度升高而增加,其摩尔数量约为     

畲族Gc、PGM1、AcP_1、6-ΡGD、ADA和AK1的遗传多态性

对畲族血浆组特异性成分（Ｇｃ）、红细胞磷酸葡萄糖变位酶１（ＰＧＭ１）、酸性磷酸酶（ＡｃＰ１）、６－磷酸葡萄糖酸脱氢酶（６－ＰＧＤ）、腺苷脱氨酶（ＡＤＡ）、腺苷酸激酶（ＡＫ１）的遗传多态性进行了研究。Ｇｃ与ＰＧＭ１是用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析的,ＡｃＰ１、６－ＰＧＤ、ＡＤＡ及ＡＫ１是用淀粉凝胶电泳分析的。各基因座的基因频率分别为Ｇｃ＊１Ｆ０．４７２２、Ｇｃ＊１Ｓ０．２４２１、Ｇｃ＊２０．２７３８;ＰＧＭ１＊１Ａ０．５３５７、ＰＧＭ１＊１Ｂ０．１６２７、ＰＧＭ１＊２Ａ０．１５８７、ＰＧＭ１＊２Ｂ０．１４２９;ＡｃＰ＊１Ａ０．１８２５、ＡｃＰ１＊Ｂ０．８１７５;６－ＰＧＤ＊Ａ０．９６８３、６－ＰＧＤ＊Ｂ０．０２７８;ＡＤＡ＊１０．９８８１、ＡＤＡ＊２０．０１１９;ＡＫ１＊１１．００００。畲族Ｇｃ、ＰＧＭ１、ＡｃＰ１、６－ＰＧＤ和ＡＤＡ基因为多态,而ＡＫ１基因为单态。发现１例带有６－ＰＧＤ＊Ｒ和３例带有Ｇｃ＊１Ａ２变异等位基因的个体,其中Ｇｃ＊１Ａ２基因频率为０．０１１９,达到多态水平。     

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达,合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列,多聚酶蛋白编码基因起码上游及内部序列３．５ｋｂＲＮＡ３＇端起始负链ＤＮＡ合成序列互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物,分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现,当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／ＬＪＦ ,四种ＯＤＮ均能抑ＨｅｐＧ２．２．１５细胞     

牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成３２个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因,即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因,而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。     

苯丙氨酸合成的关键酶基因aroG与pheA串联表达

aroG和pheA是与苯丙氨酸合成有关的两个重要基因。在大肠杆菌(Escherichia coli)中,aroG基因编码脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶(DS),该酶催化由糖代谢中心途径分流出来的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤鲜糖4磷酸(E4P)缩合形成脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸(DAHP)的反应;pheA基因编码一个双功能酶蛋白,它同时催化两步关键反应,即具有分枝酸变位酶(CM)和预苯酸脱水(PD)的两种功能。采用PCR技术分别从两个不同品系的大肠杆菌染色体DNA中扩增到aroG和pheA。当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌P2392中进行表达时,它们编码的酶DS、CM和PD活性分别提高43、44和22倍;导入短杆菌(Brevibacterium)2731中表达时,相应的酶活性分别提高123、23和56倍。两基因的串联表达能大幅度地提高工程菌株的苯丙氨酸发酵产量。     

苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达

目的:改造大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的中心代谢途径,优化关键酶基因pheA、aroF、ppsA、tktA的协同表达,进一步提高苯丙氨酸产量。方法:构建重组质粒pZE12-AFPT,鉴定后通过SDS-PAGE观察其蛋白表达量,并转入缺陷菌大肠杆菌MGΔ中构建工程菌,发酵培养后测量苯丙氨酸产量,与本室保存的重组质粒MGΔpZE12-AF做对比;构建重组质粒pZE21-AF和pZA31-PT,将后者转入感受态pZE12-AF和pZE21-AF中,得到双抗性质粒,并比较转化前后苯丙氨酸的产量。结果:工程菌MGΔpZE12-AFPT的苯丙氨酸产量比对照菌株MGΔpZE12-AF提高了近1.6倍,并且实现了4个串联基因的协同表达;质粒pZA31-PT转入pZE12-AF和pZE21-AF后,苯丙氨酸产量比原质粒pZE12-AF和pZE21-AF分别提高了近0.6倍和2.8倍。结论:实现了4个关键酶基因的串联表达,改造了苯丙氨酸的生物合成途径,使得苯丙氨酸产量有所提高,为进一步得到其高产菌株奠定了基础。     

Defective regulation of the phenylalanine biosynthetic operon in mutants of the phenylalanyl-tRNA synthetase operon.

Among mutants of Escherichia coli resistant to p-fluorophenylalanine (PFP) were some with constitutive expression of the phenylalanine biosynthetic operon (the pheA operon). This operon is repressed in the wild type by phenylalanine. The mutation in three of these mutants mapped in the aroH-aroD region of the E. coli chromosome at 37 min. A plasmid bearing wild-type DNA from this region restored p-fluorophenylalanine sensitivity and wild-type repression of the pheA operon. Analysis of subclones of this plasmid and comparison of its restriction map with published maps indicated that the mutations affecting regulation of the pheA operon lie in the structural genes for phenylalanyl-tRNA synthetase, pheST, probably in pheS. Thus, the pheST operon has a role in the regulation of phenylalanine biosynthesis, the most likely being that wild-type phenylalanyl-tRNA synthetase maintains a sufficient intracellular concentration of Phe-tRNA(Phe) for attenuation of the pheA operon in the presence of phenylalanine. A revised gene order for the 37-min region of the chromosome is reported. Read clockwise, the order is aroD, aroH, pheT, and pheS.     

Introduction of two mutations into AroG increases phenylalanine production in Escherichia coli

l-Phenylalanine is an important amino acid commercially, and therefore optimization of its manufacture is of interest. We constructed a range of mutant alleles of AroG, the enzyme involved in the first step of phenylalanine biosynthesis. Three single-site mutant alleles were constructed (aroG8, aroG15, and aroG29), which were then combined to generate three double-site aroG ^fbr mutant alleles (aroG8/15, aroG8/29, and aroG15/29). Enzymatic activity, feedback inhibition, and fermentation were analyzed in all of the mutants. All double-site mutants, except AroG15/29, showed higher enzymatic activity and greater resistance to feedback inhibition than their respective single-site mutants. The E. coli strain carrying the aroG8/15 allele produced a phenylalanine titer of 26.78 g/l, a 116 % improvement over the control phenylalanine overproducing strain (12.41 g/l). Our findings provide an effective method for modifying phenylalanine biosynthetic genes, which may be applied to optimize the commercial manufacture of phenylalanine.     

Metabolic engineering and protein directed evolution increase the yield of L-phenylalanine synthesized from glucose in Escherichia coli

L-phenylalanine (L-Phe) is an aromatic amino acid with diverse commercial applications. Technologies for industrial microbial synthesis of L-Phe using glucose as a starting raw material currently achieve a relatively low conversion yield (Y(Phe/Glc)). The purpose of this work was to study the effect of PTS (phosphotransferase transport system) inactivation and overexpression of different versions of feedback inhibition resistant chorismate mutase-prephenate dehydratase (CM-PDT) on the yield (Y(Phe/Glc)) and productivity of L-Phe synthesized from glucose. The E. coli JM101 strain and its mutant derivative PB12 (PTS(-)Glc(+) phenotype) were used as hosts. PB12 has an inactive PTS, but is capable of transporting and phosphorylating glucose by using an alternative system constituted by galactose permease (GalP) and glucokinase activities (Glk). JM101 and PB12 were transformed with three plasmids, harboring genes that encode for a feedback inhibition resistant DAHP synthase (aroG(fbr)), transketolase (tktA) and either a truncated CM-PDT (pheA(fbr)) or its derived evolved genes (pheA(ev1) or pheA(ev2)). Resting-cells experiments with these engineered strains showed that JM101 and PB12 strains expressing either pheA(ev1) or pheA(ev2) genes produced l-Phe from glucose with Y(Phe/Glc) of 0.21 and 0.33 g/g, corresponding to 38 and 60% of the maximum theoretical yield (0.55 g/g), respectively. In addition, in both engineered strains the reached q(Phe) high levels of 40 mg/g-dcw.h. The metabolic engineering strategy followed in this work, including a strain with an inactive PTS, resulted in a positive impact over the Y(Phe/Glc), enhancing it nearly 57% compared with its PTS(+) counterpart. This is the first report wherein PTS inactivation was a successful strategy to improve the Y(Phe/Glc).     

大肠杆菌CM/PDT抗反馈抑制突变体的构建及其性质

为了获得具有高催化活性且抗反馈抑制的大肠杆菌分支酸变位酶 预苯酸脱水酶 (chorismatemutase prephenatedehydrataseCM PDT) [EC5 .4 .99.5 EC4 .2 .1.5 1],通过相关菌种CM PDT氨基酸序列同源比较 ,寻找高度保守位点 .用定点突变及PCR法构建突变酶M1(缺失 30 4T、30 5G、Q30 6K)、M2 (缺失W 338)、M3(缺失 30 1～ 386位氨基酸 )、M32 9(E32 9A)和M374 (C374A) ,野生型及各突变型基因与pET2 8a(+ )载体连接后 ,表达融合蛋白 .在非变性条件下 ,由TALON金属螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白 .酶活性测定表明 ,突变体M3的PDT活性下降为野生型活性的 2 9% ,但保持了CM活性 .突变体M374保持了CM ,PDT两种酶的活性 ,突变体M1、M2、M32 9的CM ,PDT活性有一定程度的提高 .酶抗反馈抑制作用检测表明 ,突变体M3、M374解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 ,M1、M2、M32 9部分解除了苯丙氨酸的反馈抑制作用 .与含野生型pheA基因的E .coliBL2 1菌株相比 ,含突变基因的E .coliBL2 1菌株对 10mmol L的苯丙氨酸代谢类似物具有强的抗反馈抑制作用 ,其中M1,M2 ,M3对 2 0mmol L的类似物具有抗反馈抑制作用