棉铃虫Wnt-1基因克隆、多克隆抗体制备及在滞育和非滞育蛹脑中的表达检测

【目的】Wnt1蛋白是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera Wnt1基因,制备多克隆抗体,进而从蛋白水平初步研究该蛋白在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况。【方法】通过RACE的方法克隆棉铃虫Wnt1基因。根据获取的序列构建Wnt1的真核表达载体并调查其亚细胞定位,同时构建原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达、纯化后免疫兔子,制备多克隆抗体。最后用Western blot的方法检测Wnt1蛋白在两种发育状态蛹脑中的表达情况。【结果】成功克隆了棉铃虫Wnt1基因(Gen Bank登录号为KJ206240)。Wnt1定位在细胞质,通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的Wnt1抗体效价高达1∶625 000。Western blot结果表明滞育蛹脑中Wnt1蛋白水平明显低于非滞育蛹脑。【结论】获得了高效价的棉铃虫Wnt1多克隆抗体。我们的结果表明滞育蛹脑中Wnt/β-catenin通路很有可能受到抑制。本研究结果为进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫β-catenin的多克隆抗体制备及在蛹脑中的表达研究

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究构建β-catenin的原核表达载体,成功地在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达。镍柱纯化重组蛋白后免疫兔子,制备了抗棉铃虫β-catenin的多克隆抗体。ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性,结果表明抗体的效价较高,特异性较好。最后应用该抗体调查了滞育和发育蛹脑中β-catenin的表达情况,从蛋白水平证实了发育蛹脑中β-catenin高于滞育蛹脑。本研究为后续研究棉铃虫β-catenin的功能以及Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫β-catenin基因的克隆、表达分析及真核表达载体构建

β-catenin基因是生物进化上高度保守的基因,是Wnt/β-catenin信号通路中的重要组分。本研究通过RACE方法获得了棉铃虫β-catenin基因的全长c DNA序列,命名为Har-β-catenin(Gen Bank登录号为KJ206237)。其开放阅读框长2382 bp,编码793个氨基酸残基。与已报道的其它物种β-catenin蛋白相似,Har-β-catenin蛋白具有多个ARM重复结构域。运用RT-PCR的方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达情况,结果表明非滞育蛹脑中Har-β-catenin基因的表达水平高于滞育蛹脑。最后,我们构建了包含Har-β-catenin全长编码区的真核表达载体并调查了Har-β-catenin的亚细胞定位情况。这些结论为我们进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫滞育中的作用奠定了基础。     

棉铃虫激活增强子结合蛋白AP-4基因的原核表达、多克隆抗体制备、表达谱分析及功能鉴定

【目的】激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP-4)是近年来备受关注的一类功能广泛的转录因子,参与Wnt/β-catenin信号通路的调控。本研究旨在研究棉铃虫Helicoverpa armigera HaAP-4基因的原核表达并制备多克隆抗体,明确HaAP-4基因的时空表达谱,初步探究HaAP-4对棉铃虫胆固醇载体蛋白2(sterol carrier protein-2, SCP-2)基因(HaSCP-2)表达的调控作用。【方法】通过PCR扩增棉铃虫HaAP-4基因片段,将其克隆至pET-28a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21,经IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。运用RT-qPCR检测HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)以及5龄幼虫和预蛹不同组织(中肠、脂肪体、头和表皮)中的表达水平。设计并合成HaAP-4 siRNA,转染棉铃虫Ha细胞,通过RT-qPCR检测和分析使用HaAP-4 siRNA进行RNA干扰后Ha细胞中HaAP-4和HaSCP-2基因 mRNA的表达情况。【结果】成功构建pET-28a-HaAP-4重组表达质粒,在大肠杆菌细胞中获得高效表达的可溶性蛋白,目的蛋白大小约为55 kD,经纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫新西兰兔成功制备了多克隆抗体,通过Western blotting检测显示抗体具有较好的特异性,ELISA分析表明抗体效价较高。发育阶段特异性表达结果显示,HaAP-4基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在卵期、5龄幼虫期和预蛹期的表达量较高。组织表达结果表明,HaAP-4基因在5龄幼虫和预蛹不同组织中均有表达,且在中肠和头部具有高表达,而在表皮和脂肪体中表达量较低。RNA干扰实验发现,HaAP-4基因的敲降对HaSCP-2基因转录有显著影响,HaSCP-2基因mRNA表达水平下降了约55%。【结论】利用pET-28a原核表达系统能有效地在体外表达可溶性的HaAP-4,并制备了较好的多克隆抗体。RNAi实验结果提示,在中肠内高表达的HaAP-4基因能促进HaSCP-2基因的转录表达,在棉铃虫脂质生理代谢过程中发挥作用。本研究为进一步深入阐明棉铃虫HaAP-4的潜在功能打下了基础。     

松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因的克隆、原核表达及在不同滞育阶段的表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆松毛虫赤眼蜂Trichogramma dendrolimi一氧化氮合酶(NOS)基因,表达其编码蛋白,并探究其在松毛虫赤眼蜂滞育过程中的表达模式,为松毛虫赤眼蜂滞育研究提供新依据。【方法】通过转录组数据分析获得松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶基因TdNOS cDNA序列,使用qPCR方法检测其在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段预蛹和蛹中的表达量。使用RT-PCR方法扩增TdNOS cDNA序列并通过生物信息学方法分析其序列特征。构建TdNOS的原核表达载体,利用大肠杆菌Escherichia coli表达系统表达重组TdNOS蛋白,通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,并用于制备多克隆抗体。利用Western blot进一步检测TdNOS在松毛虫赤眼蜂不同滞育阶段的表达量。通过质谱鉴定纯化的目标蛋白。【结果】qPCR分析表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的相对表达量显著高于其他阶段的。克隆获得松毛虫赤眼蜂TdNOS cDNA序列(GenBank登录号:MN650600),开放阅读框(ORF)序列长1 014 bp,编码337个氨基酸,无信号肽序列,不含跨膜结构,预测有33个丝氨酸磷酸化位点、7个酪氨酸磷酸化位点和10个苏氨酸磷酸化位点。系统发育分析表明,松毛虫赤眼蜂NOS与短管赤眼蜂T.pretiosum NOS亲缘关系最近,形成与其他膜翅目昆虫NOS蛋白分离的独立分支。成功表达纯化了重组蛋白TdNOS并制备了抗体;Western blot结果表明,TdNOS在松毛虫赤眼蜂滞育解除后蛹期的蛋白表达量高于其他阶段的。质谱检测结果表明纯化的目的蛋白即为TdNOS。【结论】松毛虫赤眼蜂TdNOS在解除滞育后蛹期具有较高的蛋白及mRNA表达量。本研究为进一步探究松毛虫赤眼蜂一氧化氮合酶在滞育发育过程中的作用机制奠定了基础。     

棉铃虫Wnt1基因启动子活性研究

经典的Wnt信号通路是一条与生长发育密切相关的信号通路,经典Wnt信号通路在棉铃虫滞育蛹脑中受到抑制。本研究以棉铃虫Wnt1基因的转录调控为研究目标,对Wnt1启动子的活性进行了分析。首先,运用染色体步移的技术成功克隆了一段长为1566 bp的Wnt1启动子。然后,通过PCR扩增不同长度的启动子片段,构建到报告质粒,转染棉铃虫Hz Am1细胞并进行启动子活性分析,结果表明-1077~-1120以及-1120~-1140这两个区域对Wnt1基因的转录起着明显的激活作用。最后对这两个区域潜在的转录因子结合位点进行了预测。本研究从根本上了解棉铃虫滞育蛹脑中经典Wnt信号通路的调节机制打下了基础。     

茶足柄瘤蚜茧蜂滞育和非滞育蛹中与能量代谢相关的差异表达蛋白

【目的】本研究旨在从蛋白质组整体层面阐明茶足柄瘤蚜茧蜂Lysiphlebus testaceipes蛹滞育背后的多蛋白调控,重点筛选与能量代谢相关的滞育关联蛋白并分析其功能,有助于更好地理解茶足柄瘤蚜茧蜂蛹滞育的代谢机制。【方法】利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技术比较了茶足柄瘤蚜茧蜂滞育蛹与非滞育蛹的蛋白含量;利用GO, KEGG网络数据库等生物信息学方法分析鉴定茶足柄瘤蚜茧蜂滞育蛹与非滞育蛹中差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)。【结果】分析得到茶足柄瘤蚜茧蜂滞蛹与非滞育蛹DEPs有135个,包括滞育蛹中上调表达蛋白有38个,下调表达蛋白有97个。GO和KEGG富集分析表明,与天冬氨酸转运、L-谷氨酸转运、胆碱脱氢酶活性和胆碱生物合成甘氨酸甜菜碱条目以及氧化磷酸化通路相关的蛋白上调表达。【结论】氧化磷酸化通路相关蛋白在茶足柄瘤蚜茧蜂滞育过程中呈显著上调表达,说明能量代谢与该蜂滞育密切相关,并推测氧化磷酸化过程除为滞育蛹提供维持生命基本活动的主要能量外,还提供热能。     

伞裙追寄蝇滞育关联基因的转录组学分析

【目的】本研究旨在探讨调控伞裙追寄蝇Exorista civilis滞育的重要关联基因以及代谢途径,为明确该虫在转录组水平下的滞育分子机制提供理论基础。【方法】采用新一代高通量测序平台Illumina HiSeq^TM2000对伞裙追寄蝇非滞育以及滞育的蛹进行转录组测序分析以及生物信息学分析;应用KAAS在线pathway比对分析工具对筛选出的满足padj＜0.05且fold change≥32或padj＜0.05且fold change≤1/32条件的差异表达基因进行KEGG通路富集分析。【结果】根据测序结果,共获取58 050个基因。差异倍数在32倍以上的滞育关联基因(diapause-associated genes, DAGs)有454个,其中406个表达上调,共涉及134条通路,包括氧化磷酸化、柠檬酸循环及其他重要通路;48个表达下调,涉及32条通路。KEGG通路富集分析结果表明,滞育关联基因主要集中在信号转导、内分泌系统、碳水化合物代谢等途径中。【结论】本研究获得的伞裙追寄蝇转录组数据揭示了其滞育调控的重要代谢途径与关联基因。     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

滞育和非滞育棉铃虫血淋巴类固醇蜕皮素含量变化的比较

采用放射免疫分析法对不同时期的注定滞育和非滞育棉铃虫的血淋巴中的类固醇蜕皮素的含量进行了测定,发现在预蛹期间,注定滞育的棉铃虫的类固醇蜕皮素含量高于非滞育的棉铃虫,化蛹后,注定滞育的棉铃虫的类固醇蜕皮素含量则迅速降到极低的水平,明显低于非滞育棉铃虫。用20-羟基蜕皮素处理不同时期的滞育蛹,均能打破滞育。由此可见,类固醇蜕皮素含量的降低或缺乏乃是导致棉铃虫滞育的关键因子之一。     

取食Bt棉与玉米的越冬代棉铃虫抗寒性特征比较

【目的】针对由Bt棉花和玉米构成的华北农田景观, 探讨不同寄主作物对棉铃虫 Helicoverpa armigera 越冬抗寒的影响。【方法】2013年在河北廊坊科研中试基地的作物田中将棉铃虫幼虫接到Bt棉和玉米上, 比较取食不同作物后棉铃虫的化蛹率、存活率和越冬蛹羽化率;在室内控制条件下分别用棉蕾和鲜玉米粒饲喂棉铃虫幼虫。 测定滞育蛹和非滞育蛹的鲜重、干重、以及脂肪、糖原和低分子物质含量等指标, 比较取食不同作物后棉铃虫的抗寒能力。【结果】取食玉米的棉铃虫滞育蛹干重（117.5 mg）、脂肪含量（457.2 μg/mg DW）以及海藻糖浓度（86.45 μg/g）均显著高于取食Bt棉的棉铃虫滞育蛹干重（56.6 mg）、脂肪含量（239.6 μg/mg DW）以及海藻糖浓度（13.87 μg/g）;取食玉米的棉铃虫冰点(-10.2℃)显著低于取食Bt棉的棉铃虫冰点(-6.5℃)。【结论】结果表明取食玉米更加有利于棉铃虫越冬。 据历史数据, 近年来玉米种植面积不断增加, 这将提高棉铃虫成功越冬比率, 对棉铃虫种群扩张起到促进作用, 因此注重玉米上棉铃虫的防治尤为重要。     

Cloning and expression of the cDNA encoding the FXPRL family of peptides and a functional analysis of their effect on breaking pupal diapause in Helicoverpa armigera

Diapause hormone (DH) and pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) are encoded by a single mRNA in the suboesophegeal ganglion (SG) and are responsible for induction of embryonic diapause in Bombyx mori and sex pheromone biosynthesis in lepidopteran insects. PBAN cDNA analyses revealed that the DH-like peptide is present in several species that have a pupal diapause. However, the function of the DH-like peptide remains unknown. In the present study, we cloned the cDNA encoding DH-PBAN in Helicoverpa armigera utilizing the rapid amplification of the cDNA ends method. The nucleotide se quence analysis revealed that the longest open reading frame of this cDNA encodes a 194-amino acid precursor protein that con tains a 33-aa PBAN, a 24-aa DH-like peptide, and three other neuropeptides, all of which have a common C-terminal pentapeptide motif FXPR/KL ( X=G, T, S). A homology search showed that H. armigera DH-like and PBAN are highly homologous to those from other insects. Northern blot analysis demonstrated a single message RNA corresponding to the size of Har-DH-PBAN cDNA from pupal SG with significantly higher expression in the SG of nondiapause pupae than diapausing pupae. Western blot analysis showed DH-like peptide expression from SG of both males and females. When DH-like peptide was injected into nondiapause larvae and pupae, it did not induce diapause, but rather efficiently broke pupal diapause in H. armigera. The ED(50) of DH to terminate pupal diapause is 20 pmol/pupae. The other four FXPRLamide neuropeptides from the DH-PBAN polyprotein precursor have cross activity for diapause termination. These observations therefore suggest a potential role for these FXPRL family peptides in promoting continuous development in several noctuid species. The high expression of this gene in pharate adults and adults indicates that the FXPRL family peptides may have multiple physiological functions.     

棉铃虫脑在控制滞育中的作用

脑摘除试验表明: 棉铃虫蛹的初期发育（化蛹后12 h 内）受脑的控制;化蛹12 h后的滞育蛹发育与脑无关。注射活性脑的匀浆液可阻止部分注定滞育的预蛹和化蛹后1～2天的蛹进入滞育状态,说明滞育的个体很有可能从预蛹期开始其脑的活性就已降低。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Prothoracicotropic Hormone Acts as a Neuroendocrine Switch between Pupal Diapause and Adult Development

Diapause is a programmed developmental arrest that has evolved in a wide variety of organisms and allows them survive unfavorable seasons. This developmental state is particularly common in insects. Based on circumstantial evidence, pupal diapause has been hypothesized to result from a cessation of prothoracicotropic hormone (PTTH) secretion from the brain. Here, we provide direct evidence for this classical hypothesis by determining both the PTTH titer in the hemolymph and the PTTH content in the brain of diapause pupae in the cabbage army moth Mamestra brassicae. For this purpose, we cloned the PTTH gene, produced PTTH-specific antibodies, and developed a highly sensitive immunoassay for PTTH. While the hemolymph PTTH titer in non-diapause pupae was maintained at high levels after pupation, the titer in diapause pupae dropped to an undetectable level. In contrast, the PTTH content of the post-pupation brain was higher in diapause animals than in non-diapause animals. These results clearly demonstrate that diapause pupae have sufficient PTTH in their brain, but they do not release it into the hemolymph. Injecting PTTH into diapause pupae immediately after pupation induced adult development, showing that a lack of PTTH is a necessary and sufficient condition for inducing pupal diapause. Most interestingly, in diapause-destined larvae, lower hemolymph titers of PTTH and reduced PTTH gene expression were observed for 4 and 2 days, respectively, prior to pupation. This discovery demonstrates that the diapause program is already manifested in the PTTH neurons as early as the mid final instar stage.