利用转座子Tn233(CH)与Tn5作为基因载体的研究

用体外重组技术构建了转座子Tn233(CH)、Tn233△E14与Tn5的3个衍生物:(1)转座子Tn 233(CH)含有单个BgBlⅡ限制位点,将从质粒pTK 63来的含K 88抗原基因的BamHI片段连接到pBR322::Tn233(CH)的BglⅡ位点上,形成了pBR322::Tn233(K88)。(2)Tn233△E14是Tn233的缺失变种,此缺失除去了Tn233(CH)上的TnpA基因,但保留了BglⅡ位点,将同上面一样的BamHI片段克隆到pBR322::Tn233△E14的BglⅡ位点上,构建了pBR322::Tn233△E14(K88)。(3)Tn5含有1个BamHI限制位点,pTB341是1个有Tn5插入的质粒,pTB341经BamHI切割后得到3个BamHI片段,每个片段分别带有Ap~r基因;IS50L与Km~r基因;IS50R与Sm~r基因,当此3个片段经T4-DNA连接酶重新连接后,分离到了1个质粒pTS40,此质粒也由此3片段组成,但它们的排列与pTB341的不同,此重新连接的结果使Ap~r基因成为Tn5中的一部分。 遗传实验结果表明,K88抗原基因与Ap~r基因在这些转座子衍生物中能够表达,而且新构建的Tn233(K88)与Tn5(Ap)仍保留着转座的能力。当在反式位置上有TnpA基因时,Tn233△E14(K88)也能从pBR322::Tn233△E14(K88)转座到其它质粒上。     

转座子Tn233(CH)中抗性基因的定位

将Tn233(CH)从质粒DR233转座到可以扩增的质粒pBR322上,并绘制了包括7种限制性内切酶切点的pBR322:: Tn233(CH)DNA的限制图。经限制类型分析表明,链霉素抗性基因位于H3片段上,磺胺抗性基因位于H4片段上,汞盐抗性基因位于H1片段上。另外,B3片段上同时带有链霉素与磺胺的抗性基因,B1片段上带有汞盐抗性基因。     

转座子Tn233(CH)链霉素敏感突变种及其回变种的研究

转座子Tn233-1(CH)是Tn233(CH)的链霉素敏感突变种,比较了突变种质粒pBR322:: Tn233-1(CH)DNA和野生型质粒pBR322::Tn233(CH)DNA的EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ与PstI限制性内切酶图谱,结果表明Tn233-1(CH)中带链霉素抗性基因的限制片段H3上插入了一个约800bp长的IS因子,在这个插入的DNA片段上有一个PstI切点而没有EcoRⅠ、BamHⅠ及HindⅢ切点。 对链霉素抗性回变种的质粒DNA pBR322:: Tn233-1-R(CH)的限制图谱加以分析后表明,插入在H3限制性片段上的IS因子已经切除,但是限制片段E2与E3的长度发生了改变。此外,在限制片段E2上出现了一个新的IS插入片段,在这一插入片段上有一个HindⅢ与PstⅠ切点。我们对此突变与回变的机理进行了讨论。     

转座子Tn233(CH)中转座基因的鉴定和定位

Tn233(CH)是从国内临床分离的耐药痢疾杆菌中找到的一个转座子,已经绘制了它的物理图,它与转座子Tn21基本相同。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对带有转座子Tn233(CH)的质粒pBR322::Tn233(CH)进行不完全消化,如此产生的DNA片段经T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli C600细胞中,获得了一些保留有转座功能或失去了转座功能的转座子缺失变种。互补试验的结果表明,保留有转座功能的Tn233(CH)缺失变种在反式位置上对失去了转座功能的Tn233(CH)缺失变种有互补作用。对这些缺失变种在DNA上缺失的区域进行限制图分析,确定了转座子Tn233(CH)中转座基因的位置。     

转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。     

转座子Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间转座功能互补与转座免疫的研究

Tn4(sm~rSu~rAp~r)、Tn3(Ap~r)与Tn233(CH)(Sm~rSu~rHg~r)是结构上相关而且都属于TnA家族的转座子。据报道Tn4中还含有一个拷贝的Tn3。为了弄清它们在家系中的关系,我们进行了Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间的转座功能互补与转座免疫的研究。结果如下:(1)当Tn4以反式状态存在时,Tn233(CH)转座功能缺失的tnpA~-变种(Ta233△E12)的转座能力可以恢复,但Tn3不能使之恢复;(2)Tn233(CH)能转座到质粒R144drd3::Tn4或R144drd3::Tn3上形成带二个转座子的质粒;(3)带二个转座子的质粒会失去二种不同转座子中的一种。当寄主细胞在无抗生素的营养培养基上移种5—15次后,仍带有二种转座子共存质粒R144drd3::Tn233::△E15::Tn233△B5的细胞的百分率只有8.3％;与此相比,在相同的情况下,带R144drd3::Tn4::Tn233(CH)的细胞的百分率为71.2—86.2％,带R144drd3::Tn3::Tn233(CH)的细胞的百分率为96.2％。     

转座子Tn233(CH)缺失突变株特性的研究

将带有质粒pBR322::Tn233(CH)(抗药类型为Ap~rTc~rSm~rSu~rHg~r)的大肠杆菌C600ML(多聚酶Ⅰ温度敏感突变株)在非允许温度条件下培养时,分离到12株营养缺陷突变型,其中10株的抗药类型为Sm~rSu~rHg~r,经质粒DNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析表明,除1株(突变型3号)仍有质粒DNA外,其它9株细胞中的质粒DNA已不复存在。在12株中另外2株的抗药类型为sm~rSu~r(突变型19号与41号),它们也仍旧带有质粒DNA,经质粒抽提与限制性内切酶分析表明,这3种质粒(分别称为pTD3,pTD19与pTD41)DNA分别比pBR322::Tn233(CH)少了一些相邻的限制片段,经计算,pTD3缺失了1.33kb,pTD19缺失了7.22kb,pTD41缺失了9.09kb。从质粒的遗传图上可以看出,这3株缺失质粒都保留了pBR322载体上的DNA复制点与Tn233(CH)上的转座基因(TnpA),但是Tn233(CH)与pBR322相连处的两个末端反向重复顺序中的一个已经缺失,实验表明它们可能都失去了转座功能。对这些自发产生的缺失变种在转座子演化上的意义进行了讨论。     

α-氨基苄青霉素抗性转座子Tn2在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入区域特异性

转座子Tn2是大肠杆菌质粒RSF 1030上一段带有α-氨基苄青霉素抗性基因的DNA序列。这段序列具有转座能力,它能通过不同于一般的DNA重组机理从一个复制子转座到另一个复制子。已知,噬菌体Mu,插入序列IS1、IS2、IS3和抗药性转座子TnA、Tn5、Tn9、Tn10等均能使被插入的基因发生突变。已有报道,不同的转座子在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入模式不同。Mu噬菌体在Z基因     

转座子Tn4560在吸水链霉菌应城变种中的转座

Tn4556是在弗氏链霉菌UC8592中发现的一个类似于Tn3的转座子,在它转坐的非必需区中间插入紫霉素抗性基因vph所组成的复合体(Tn4556::vph),称为Tn4560.把Tn4560克隆到一个温敏性质粒pMT660(由PIJ702衍生而来)构建的重组质粒(pMT660::Tn4560)称为pUC1169.pUC1169不能直接转化吸水链霉菌应城变种1O-22,但可以以一定的频率转化其衍生菌株Q105(至少丧失了一个内源质粒的受体菌株.)从转化子中检测DNA,可以观察到完整的PUC1169的存在(仍为高拷贝).将携带了pUC1169的Q105菌株的孢子悬液以一定的稀释度涂布到无抗生素的平板上获得单个分散的菌株,把平板放在39℃下培养,待菌落长出丰满的孢子后,再分别影印到含有紫霉素和硫链丝菌素的培养基平板上,分离紫霉素抗性(vio~r)和硫链丝菌素敏感(thio~s)的菌落,即为pMT660“自杀”,而Tn4560在细胞中发生了转座的个体.从18个这类菌落中提取总DNA,经PvuⅡ酶解后,在琼脂糖凝胶上电泳,把电泳后的DNA转移到硝酸纤维膜上,与非放射性方法标记的pUC1169探针杂交揭示,每一个衍生菌…     

小麦新抗源CH5383抗条锈病基因的遗传分析及分子定位

CH5383是新育成的源于中间偃麦草的渗入系,对小麦条锈病和白粉病均表现免疫。为明确其抗性来源、遗传方式和抗病基因在染色体上的位置,将CH5383的系谱材料及其与高感条锈病品种(系)杂交的F1、F2和F2:3家系群体进行条锈病抗性鉴定。结果表明,CH5383对条锈病的抗性源于中间偃麦草,对条锈病生理小种CYR32的抗性由一对显性核基因控制,将此基因暂时命名为YrCH5383。从476对SSR引物中筛选到3对引物Xgwm108、Xbarc206和Xbarc77与抗病基因连锁,遗传距离分别是8.2 cM、10.7 cM和13.6 cM。根据这两对标记在染色体上的位置,将抗病基因定位到3B染色体的长臂上。3B染色体的长臂还未见有正式命名的抗条锈病基因的报道,推测YrCH5383可能是一个源于中间偃麦草的新抗条锈病基因。     

转座子Tn4560在吸水链霉菌应城变种中的转座

Tn4556是在弗氏链霉菌UC8592中发现的一个类似于Tn3的转座子,在它转坐的非必需区中间插入紫霉素抗性基因vph所组成的复合体(Tn4556::vph),称为Tn4560.把Tn4560克隆到一个温敏性质粒pMT660(由PIJ702衍生而来)构建的重组质粒(pMT660::Tn4560)称为pUC1169.pUC1169不能直接转化吸水链霉菌应城变种1O-22,但可以以一定的频率转化其衍生菌株Q105(至少丧失了一个内源质粒的受体菌株.)从转化子中检测DNA,可以观察到完整的PUC1169的存在(仍为高拷贝).将携带了pUC1169的Q105菌株的孢子悬液以一定的稀释度涂布到无抗生素的平板上获得单个分散的菌株,把平板放在39℃下培养,待菌落长出丰满的孢子后,再分别影印到含有紫霉素和硫链丝菌素的培养基平板上,分离紫霉素抗性(vio^r)和硫链丝菌素敏感(thio^s)的菌落,即为pMT660“自杀”,而Tn4560在细胞中发生了转座的个体.从18个这类菌落中提取总DNA,经PvuⅡ酶解后,在琼脂糖凝胶上电泳,把电泳后的DNA转移到硝酸纤维膜上,与非放射性方法标记的pUC1169探针杂交揭示,每一个衍生菌株都丢失了对应于载体PMT660的区域,却在染色体或内源质粒的不同位点上保留了Tn4560.从vio^r thio^s的突变体中已获得了5102-Ⅲ抗生素生物合成的阻断突变株.     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

大肠杆菌的一个转座子Tn2981的特性

在复旦大学校园分离到1株带有抗药性质粒pFD13(Sm~RSu~RCm~RTc~RHg~R)的大肠杆菌B7,并在pFD13上发现1个转座子,它带有链霉素(Sm~R)、汞盐(Hg~R)、磺胺嘧啶(Su~R)抗性基因,定名为Tn2981。Tn2981可以从质粒pFD13转座到质粒R144drd3上,也能从质粒转座到大肠杆菌的染色体上。这种转座作用不依赖于宿主细胞reeA的基因产物。经电子显微镜测量质粒pBR322::Tn2981及质粒pBR322的长度,换算后得到Tn2981分子量是12.48×10~6道尔顿,并经限制性内切酶酶切说明它含有6个EeoRI切点。     

依尼奥小单孢菌抗性基因sisR的克隆研究

从产西索米星的依尼奥小单孢菌中克隆高抗性新基因sisR,借助计算机设计PCR引物,从西索米星的产生菌依尼奥小单孢菌的染色体DNA中,经PCR扩增获得DNA序列长度不等的DNA片段。将这些DNA片段克隆至pUC19载体质粒并导入大肠杆菌,从中筛选到5个抗西索米星的转化子(其中一个命名为sisR)显示对西索米星的高抗性(超过1000μg/mL)。经DNA测序并通过互联网Biast比对,确认对该抗性负责的DNA片段是一个未见报道的新基因。     

紫云英根瘤菌胞外多糖缺陷型变种的分离及遗传分析

经转座子Tn5诱变,获得20株紫云英根瘤菌菌株109胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)缺陷型(Eps-deficient,Exo-)变种。这些变种仍都是原养型,在含不同的碳底物或不同浓度碳底物的固体培养基上,菌落型态均无改变。与亲本菌相比,变种的EPS产量明显降低。所有变种未能在其宿主植物紫云英上结瘤。利用载体质粒pMN2,经Exo-变种与大肠杆菌受体菌交配,通过选择Tn5卡那霉素抗性标记的转移,构建成带有Tn5及菌株109多糖基因DNA片段的R－prime质粒。R-prime质粒能稳定地存在于菌株109中。大部分变种的Exc-表型能被R-prime质粒互补,但R-prime质粒未能使这些Exo-变种恢复有效结瘤的共生能力。根据互补结果,20株Exo-变种分为6种不同的互补群,其中5种互补群的多糖位点在遗传上是连锁的。     

依尼奥小单孢菌抗性基因sisR的克隆研究

从产西索米星的依尼奥小单孢菌中克隆高抗性新基因sisR ,借助计算机设计PCR引物 ,从西索米星的产生菌依尼奥小单孢菌的染色体DNA中 ,经PCR扩增获得DNA序列长度不等的DNA片段。将这些DNA片段克隆至pUC19载体质粒并导入大肠杆菌 ,从中筛选到 5个抗西索米星的转化子 (其中一个命名为sisR)显示对西索米星的高抗性 (超过 10 0 0 μg mL)。经DNA测序并通过互联网Blast比对 ,确认对该抗性负责的DNA片段是一个未见报道的新基因。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/Hin dⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后加收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3．3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT－1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100％,解离后的质粒稳定性为93％。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

根瘤菌共生固氮的遗传学研究(二)

2.在根瘤菌研究中成功地运用了转座子诱变技术。转座子(Transposon)是一种特殊的DNA短片段,它带有抗药性基因,并具有在DNA复制子之间转座插入的能力,转座的发生并不需要recA基因产物,一些转座子象Tn 5的转座插入位点的分布是相当随机的,但另一些象Tn 10,它的转座插入似乎具有“热点”(Hot spot),转座子插入到一个新位点时,被插入位点原基因的连续性受到阻断,因而该基因的功     

小偃麦衍生品系CH7086抗白粉基因的遗传及SSR分析

CH7086是兼抗白粉病、条锈病的小麦新品系,衍牛于来自十倍体长穗偃麦草的八倍体小偃麦与普通小麦的杂种后代.温室接种鉴定结果显示,CH7086对白粉病菌系E09、E21、E26均表现为免疫,且其抗件来自长穗偃麦草.抗性遗传分析表明CH7086的白粉病抗性由1对显性基因控制,暂定名为MlCH86.应用分离群体分组法(BSA)对从CH5241×CH7086的F2中随机选取的95个单株进行微卫星标记检测,发现位于2BL、2DL上的SSR位点Xbarc159在双亲和抗、感池间有特异性,并与抗性基因MlCH86连锁,其遗传距离为10.8 cM.用中国春第2部分同源群的缺体-四体系和双端体系进行验证,进一步将MlCH86定位在2BL上.用白粉病菌系E21、E26接种鉴定表明,MlCH86的抗性反应明显不同于2BL上已命名的抗性基因Pm6、Pm33.根据抗性基因的来源、染色体位置及抗性反应,初步推断存在于CH7086的抗性基因来自长穗偃麦草,它不同于已有的抗白粉病基因,可能是一个新基因.