蛙科两栖动物皮肤抗菌肽的分子多样性及功能

摘要: 蛙科(Ranidae)是全球分布最广泛的两栖动物, 种类超过650种。为开拓和适应广阔的栖息地及多样的生态环境, 其皮肤腺体中进化产生了结构复杂、种类繁多的抗菌肽。它们除具有广谱抗菌活性外, 还有抗肿瘤、抗病毒等生物学活性。蛙科动物皮肤抗菌肽起源于共同祖先, 在漫长的进化过程中, 基因发生了多重复制和突变, 形成了天然抗菌肽的巨大资源库。这些肽在模拟膜的溶剂中几乎都是疏水的, 并带正电荷, 以一种两亲性的α-螺旋的构象存在。根据氨基酸组成及结构的相似性, 可以将蛙科动物抗菌肽分成brevinin-1、esculentin-1、esculentin-2、temporin、ranalexin、ranatuerin-1、ranatuerin-2、plaustrin、brevinin-2、tigerinin、japonicin、nigrocin和melittin相关肽等若干个家族。文章结合作者的研究工作, 综述了目前已经鉴定的蛙科动物皮肤抗菌肽的分子多样性特点、家族性质和生物学活性的研究进展, 并阐述了东北林蛙新家族抗菌肽的特点。 关键词: 蛙科; 抗菌肽家族; 分子多样性; 生物学活性     

云南昆明地区三种蛙皮肤显微结构的比较

对昆明地区的多疣狭口蛙、昭觉林蛙及黑斑蛙的背腹皮肤切片的显微结构进行了观察和比较,尤其对它们皮肤腺体的类型和功能进行了比较分析.结果 表明:多疣狭口蛙皮肤比昭觉林蛙及黑斑蛙皮肤含有更多的腺体,尤其是颗粒腺比后两者含量更为丰富,并且在皮下存在许多腺体团,背腹皮肤较后者厚.昭觉林蛙皮肤较黑斑蛙的含有更多的颗粒腺和粘液腺.3种蛙的背部皮肤都含有色素细胞,而除了在多疣狭口蛙雌性腹部观察到少量色素细胞外,另两种蛙在腹部皮肤中均未见色素层.相比之下,昭觉林蛙和黑斑蛙皮肤结构较相似,两者同多疣狭口蛙在皮肤腺体分布及数量上差别较大,这也体现了三者不同的生态适应机制.     

蛙类皮肤分泌物中的抗菌肽和抗癌肽

蛙类的皮肤分泌物中包括了种类繁多,功能复杂的生理活性物质。本文从抗菌肽的杀菌机理出发,综述了蛙类的皮肤分泌物近几年的最新研究进展,重点介绍了抗菌肽结构和功能的关系,。并报告了抗癌肽的最新研究进展以及蛙类活性肽在临床上的应用前景。     

骨髓间充质干细胞亲和肽MMP底物肽复合物的构建及其作为小分子药物载体的初步研究

为了探讨骨髓间充质干细胞亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）底物肽复合后作为小分子药物载体的可行性,采用噬茵体肽库技术,用分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mousemesenchymalstemcells,MSCs）筛选噬菌体环七肽库,获得MSCs高亲和性多肽．合成FrrC（Frrc—CSTNPKVLC,FITC．P1）和生物素（Biotin—CSTNPKVLC,Bio-PI）标记的亲和肽,流式细胞术和ELISA方法检测其与MSCs的亲和性;将DAPI标记的MSC-Bio-P1复合物植入裸鼠肿瘤组织周围,检测复合物在体内的稳定性．将亲和肽与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）特异性底物肽（GPLGIAGQ）连接,合成FITC标记的亲和肽．底物肽复合物（FITC-Ahx-CSTNPKVLCGPLGIAGQ,FITC—P1-P2）,通过流式细胞术检测其对MSCs的亲和性,毛细管电泳方法检测MMP对FITC-P1-P2的酶切效果．结果表明,通过噬菌体肽库筛选获得的MSCs亲和肽,在体内外对MSCs均具有良好的亲和性和稳定性;亲和肽与底物肽的复合物（FTTC—P1-P2）对MSCs仍有较好的亲和性,并且能够被MMPs酶切．以上研究表明,MSCs亲和肽．MMP底物肽复合物（CSTNPKVLCGPLGIAGQ,P1-P2）可以作为MSCs与小分子药物相连的连接子,从而对MSCs作为小分子药物（如化学药物）载体的可行性提供了实验依据．     

棕点湍蛙皮肤分泌液中促胰岛素释放肽的分离纯化、基因克隆及活性分析

通过分离纯化棕点湍蛙(Amolops loloensis)皮肤分泌液中的生物活性物质,得到有促胰岛素释放活性的分离峰,并鉴定其结构.采用葡聚糖Sephadex G-50凝胶层析和反相高效液相(RP-HPLC)等手段对棕点湍蛙皮肤分泌液进行分离纯化,利用胰岛素释放实验进行活性检测,Edman降解法测定活性峰的氨基酸序列,反转录法构建cDNA文库并克隆其基因.得到一个具有显著的促胰岛素释放活性的十六肽,测得其氨基酸序列为:FMPIvGKsMSGLSGKL-NH2,命名为amolopin-1.由cDNA(开放阅读框为192bp)推导的氨基酸一级结构显示,其前体由64个氨基酸残基(aa)组成,包括高度保守的信号肽(22aa),酸性肽以及成熟肽.经过数据库序列比对,从棕点湍蛙皮肤中得到一个新的促胰岛素释放肽,进一步分析其作用机理和药代动力学,极有可能得到一个新的治疗糖尿病的降糖药物.     

脑啡肽类似物与阿片受体亚型的结合

为了探讨脑啡肽类似物与不同受体亚型的结合,我们用液相法所合成的一系列类似物,以豚鼠回肠和小白鼠输精管作为测定类似物对不同受体亚型结合活性的模型,并用放射受体分析法测定了这些类似物对阿片受体的活力,最后我们还用小白鼠热板法测定了它们的镇痛效果。我们发现脑啡肽分子第五位氨基酸侧链的疏水性和游离羧基对δ-受体结合特别重要。对μ-受体来说第五位氨基酸不一定是必需的,而羧端的游离羧基对μ-受体的结合是不利的。第二位甘氨酸被D-氨基酸取代后无论对δ-受体或μ-受体的结合能力都可以提高,但如果D-氨基酸的侧链过于庞大,则大大影响对δ-受体的结合能力。第四位苯丙氨酸对δ-受体来说必须具有典型的苯丙氨酸芳香族。δ-受体对脑啡肽分子的结构要求更为严格,而镇痛活性基本上与μ-受体结合的活性相平行,而与δ-受体结合的活性关系不大。合成的[DAla~2-DSer(Bzl)~5]Enk类似物在与δ-受体上的活力,比已报道的[DAla~2—Ser(Bzl)~5]Enk还要高一倍多,而[DAla—(N—CH_3)Phe~4—DSer(Bzl)~5]Enk的镇痛效果比吗啡要高300倍以上。     

骨骼基因分化特征研究

两栖类动物是如何在空气中保持其裸露皮肤免受自由基的伤害,不论从进化的角度或对动物皮肤生物学感兴趣的研究者来说,都是个很重要的问题。中国科学家从大绿蛙的皮肤中新发现了名为antioxidin-RL的抗氧化小肽,这为抗氧化 氧化肽系统在两栖类动物皮肤中可能广泛存在提供了佐证。     

7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选肿瘤坏死因子alpha拮抗肽的比较

肿瘤坏死因子alpha的拮抗剂是治疗多种炎症性自身免疫疾病的首选,但抗体类拮抗物因副作用明显而使用受限,尤其是机体内抗抗体的产生,严重影响治疗效果和药物代谢。而肽类物除免疫原性低之外,和小分子相比也有更低的毒性和更强的靶标特异性。使用7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选TNFα拮抗肽,以分析7肽和12肽分别作为TNFα拮抗肽的亲和性与功能性。经过3~4轮的筛选和验证,得到2条7肽序列和2条12肽序列。利用ELISA方法检测合成肽与TNFα结合的亲和性,编号632的7肽亲和性最强,Kd=138nmol/L;编号636的12肽亲和性稍差,Kd=8.59μmol/L。InsightⅡ软件分别分析632肽和636肽与TNFα二聚体结合,发现632肽与TNFα二聚体结合更加稳定,并且在细胞水平上632肽拮抗TNFα活性功能比636肽更强,有632肽存在的条件下TNFα诱导的L929细胞生存率上升了3倍,而636肽的作用只有2倍。7肽比12肽更适合作为TNFα拮抗肽。     

直接多肽结合试验组合人细胞系活化试验预测皮肤致敏物的探讨

目的建立直接多肽结合试验(DPRA)和人细胞系活化试验(h-CLAT)的皮肤致敏组合检测方法,对化学品及植物提取物的致敏性进行初筛。方法选择12种化学品和7种植物提取物为受试物,把不同受试物分别与两种肽(半胱氨酸肽和赖氨酸肽)共孵育24 h,采用高效液相色谱法分析反应后多肽消耗。同时将不同浓度的受试物与体外培养的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)共孵育24 h,通过流式细胞仪检测暴露后细胞表面标志物CD86和CD54的变化。再进一步比较DPRA和h-CLAT预测结果的一致性。结果 DPRA方法和h-CLAT方法准确区分了12种化学品的皮肤致敏性,其中2种判定为阴性,10种判定为阳性,两种方法检测结果一致。DPRA对植物提取物致敏性的预测中,除绿茶提取物无法判定外,其余6种均为皮肤致敏疑似物质。h-CLAT预测中,除绿茶提取物、马齿笕提取物和人参果提取物为非致敏物,其余4种植物提取物为致敏物。DPRA与h-CLAT预测的一致性为0.57。结论 DPRA与h-CLAT的简单组合可以实现对单一化合物的准确预测,对于复杂混合物可实现初步预测,确认需要进一步组合其他方法。     

《国际生物化学与分子生物学》：科学家发现蛙类皮肤中强效促皮肤创伤修复肽

为研究减少慢性皮肤溃疡的发病率、降低其致残率、死亡率。中科院昆明动物研究所研究员赖仞课题组从无指盘臭蛙皮肤中鉴定出一条强效促皮肤创伤修复肽，希望能开发出安全、低毒、高效的促皮肤愈合候选药物。该研究成果发表在《国际生物化学与分子生物学》杂志上。     

镉在黑斑蛙组织的积累与分布

研究民镉暴露实验中黑斑蛙不同器官组织对镉的吸收积累,并对其在不同器官组织中的分布规律进行了分析。结果表明：镉在黑斑蛙器官组织的积累具有选择性,主要积累在肠和肝脏中,其次是皮肤、肌肉,而骨骼中没有积累。     

液相色谱-串联质谱分析化学合成多肽及其主要副产物(英文)

用与反相高效液相色谱偶联的串联质谱 (RPHPLC MS MS)分析一个固相化学合成的九肽H2 N Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys CONH2 及其 2个主要的副产物 .根据Fmoc化学 ,在Fmoc PAL PEG·PS树脂上从C端至N端手工操作逐步偶联合成九肽 .偶联完成后 ,用试剂R(90 %TFA ,5 %苯甲硫醚 ,3%二巯基乙烷 ,2 %苯甲醚 )室温 (2 0～ 2 5℃ )处理 2 5h ,进行多肽的去保护和切除树脂 .RP HPLC分析结果表明 ,合成粗品中含有 1个主要成分、2个次要成分及多个微量成分 .用RPHPLC MS MS分别对主要成分和 2个次要成分进行了鉴定 .结果证明 ,主要成分即为目标九肽 ;先于目标肽洗脱的副产物分子量比目标肽的分子量多 16 .MS MS证明 ,该副产物包括 2种九肽衍生物 :1种为其Tyr1氧化生成 ,另 1种为Met6氧化生成 ;后于目标肽洗脱的副产物为九肽的Tyr1残基增加 12所致 ,这种现象尚未见报道 .对副产物形成的可能机制进行了讨论     

两种A类氨基酸转运蛋白部分功能差异的研究

应用重组Vaccinia病毒表达系统在猴肾成纤维细胞CV—1中瞬时表达大鼠A类氨基酸转运蛋白GlnT和SAT—2,研究它们转运MeAIB、Ala和Gln的动力学和对多种氨基酸转运亲和性的差异,结合它们的氨基酸序列同源性比较表明：虽然GlnT和SALT—2蛋白的氨基酸序列有较高的同源性,但它们在转运功能上有较大的差异。     

内吗啡肽-2的人工合成及其酶促降解

内吗啡肽-2(endomorphin-2)是Zadina等人[1]于1997年发现的一种具有镇痛作用的四肽,它存在于动物和人的中枢神经系统内[2].它是内源性μ阿片受体的激动剂,具有高亲合性(K1=690pmol,L)和选择性(δ/μ=13400、K/μ=7600).     

犬种布鲁氏菌ZG株单克隆抗体4H3抗原模拟表位的筛选及分析

【背景】目前犬布鲁氏菌病诊断存在一定的困难。【目的】筛选并研究犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株的特异性抗原表位。【方法】利用噬菌体肽库展示技术,以犬种布鲁氏菌单克隆抗体4H3株作为靶分子,包被酶标板,用12肽随机肽库经过3轮生物淘洗程序进行筛选。经过3轮筛选后,噬菌体产出率从5.00×10^-7增加到9.84×10^-6,假阳性率逐轮降低。从第3轮筛选的阳性克隆中随机挑取14个进行增殖,提取基因组DNA,进行测序分析;并通过iELISA和cELISA检测阳性克隆的亲和性和特异性。【结果】14株阳性单克隆噬菌体共出现3种不同的短肽序列,分别是KMSIRHPIRLPI、ILRRRRKRIIQI和QRIHMRLTTQS;iELISA结果表明3种短肽序列与单克隆抗体的亲和性依次为KMSIRHPIRLPI>ILRRRRKRIIQI>QRIHMRLTTQS;cELISA结果显示短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI特异性较强。对亲和性较强、特异性较高的2条短肽KMSIRHPIRLPI和ILRRRRKRIIQI展开具体分析,比对分析表...     

昆明滇蛙和昭觉林蛙食物比较及益害评价

:对1998年5月—2003年11月采自昆明白龙寺、花红洞及西街口的1105只滇蛙(Rana pleuraden)及428只昭觉林蛙(Rana chaochiaoensis),采用剖胃法作食性分析,分别计算它们的食物数量和频次百分比、α多样性指数、百分率相似性指数、营养生态位宽度、营养生态位重叠值和有益系数等。分析和计算结果显示,不同采集地的滇蛙以及滇蛙与昭觉林蛙之间的主要食物组成基本相同;但两种蛙之间,甚至同一物种的雌雄之间的食物多样性及营养生态位均存在分化。滇蛙和昭觉林蛙周年的有益系数都为正值,说明它们对人类的益处大于害处,其中又以滇蛙的有益程度较昭觉林蛙的高。研究结果表明,同一物种采自不同地域的种群和(或)同一种群采自不同的季节或年份,其有益系数均具可变性,即有益系数不具可比性。此系数仅表示蛙在一定时期对人类的益害程度。     

脑啡肽类似物与阿片受体亚型的结合

为了探讨脑啡肽类似物与不同受体亚型的结合,我们用液相法所合成的一系列类似物,以豚鼠回肠和小白鼠输精管作为测定类似物对不同受体亚型结合活性的模型,并用放射受体分析法测定了这些类似物对阿片受体的活力,最后我们还用小白鼠热板法测定了它们的镇痛效果。我们发现脑啡肽分子第五位氨基酸侧链的疏水性和游离羧基对δ-受体结合特别重要。对μ-受体来说第五位氨基酸不一定是必需的,而羧端的游离羧基对μ-受体的结合是不利的。第二位甘氨酸被D-氨基酸取代后无论对δ-受体或μ-受体的结合能力都可以提高,但如果D-氨基酸的侧链过于庞大,则大大影响对δ-受体的结合能力。第四位苯丙氨酸对δ-受体来说必须具有典型的苯丙氨酸芳香族。δ-受体对脑啡肽分子的结构要求更为严格,而镇痛活性基本上与μ-受体结合的活性相平行,而与δ-受体结合的活性关系不大。合成的[DAla~2-DSer(Bzl)~5]Enk类似物在与δ-受体上的活力,比已报道的[DAla~2-Ser(Bzl)~5]Enk还要高一倍多,而[DAla-(N-CH_3)Phe~4-DSer(Bzl)~5]Enk的镇痛效果比吗啡要高300倍以上。     

唐古特白刺叶性状及叶片δ13C、δ15N沿降水梯度的变化特征

叶片性状反映了植物对环境的适应能力及自我调控能力。以唐古特白刺天然种群为研究对象,沿300—40 mm年降水梯度,测定了7个样地的唐古特白刺叶片性状及叶片δ~(13)C、δ~(15)N。结果表明:(1)沿降水梯度变化,7个地区唐古特白刺叶宽、长宽比、叶厚、叶面积、比叶面积、叶氮含量、叶片δ~(13)C和δ~(15)N变异性显著(P0.05),而叶长差异不显著(P0.05)。唐古特白刺通过叶片各功能性状间的调节来适应环境的变化,并形成性状间的最佳功能组合。(2)唐古特白刺叶片δ~(13)C与叶面积、比叶面积呈负相关关系,与叶氮含量呈正相关关系,但其相关性均未达到显著性水平(P0.05),仅与地下水埋深表现出了极显著的正相关关系(P0.01)。在降水量小于100 mm的区域,白刺主要利用地下水源,成为隐域植被,从而降低了对其他环境因子的响应。(3)叶片厚度和叶氮含量可以作为体现不同地区间唐古特白刺差异的叶功能性状。数据显示叶片厚度与年平均温度正相关(P0.05),尤其与年最高气温大于35℃日数关系更为密切(P0.01);在高温环境下,叶片增厚的同时叶氮含量显著降低(P0.05),而这一过程中叶片δ~(15)N值却有增加趋势(R~2=0.62,P0.05),因此叶厚度和叶氮含量对叶片δ~(15)N的相对影响在干旱与半干旱区之间发生转变,这为进一步探究干旱区荒漠植被的水分限制阈值提供了新思路。     

植物细胞中间纤维角蛋白性质的分析

角蛋白是植物细胞中间纤维的主要。应用选择性抽提和生物化学技术,分离纯化了豌豆根尖细胞５８、５２ｋＤ、白菜叶５２ｋＤ和胡萝卜悬浮细胞６４ＫＤ角蛋白,测定了它们的氨基酸组成,结果表明上述角蛋白与动物细胞中间纤维角蛋白 氨基酸组成有较大的相似性。比较了动、植物细胞角蛋白肽谱、结果显示它们之间存在较大的差异,但是植物细胞嶂角蛋白肽谱比较一致,这提示它们属于同一蛋白家族,为植物中间纤维及其蛋白 存在提供了新     

蛙科物种背侧褶组织形态特征

背侧褶是无尾两栖类的重要形态特征,但对于其组织结构和功能缺乏了解。本文运用组织学技术,H.E、AB-PAS和Masson三色三种染色方法对蛙科4属的代表物种滇蛙（Dianrana pleuraden）、阔褶蛙（Sylvirana latouchii）、仙琴蛙（Nidirana daunchina）、沼蛙（Boulengerana guentheri）背侧褶和背部皮肤的显微结构进行了系统的比较研究。结果发现：1）蛙科物种的皮肤腺体单元丰富多样,由黏液腺和颗粒腺组成。其黏液腺均为普通黏液腺,按照其分泌物及分泌细胞形态将黏液腺分为Ⅰ型黏液腺和Ⅱ型黏液腺。Ⅰ型黏液腺在沼蛙和仙琴蛙中缺失,Ⅱ型普遍分布。颗粒腺分Ⅰ型颗粒腺、Ⅱ型颗粒腺及特化颗粒腺,Ⅱ型颗粒腺仅见于仙琴蛙,特化颗粒腺仅见于阔褶蛙和沼蛙的背侧褶;2）滇蛙与仙琴蛙背侧褶基本结构与其背部常规皮肤一致,且两种皮肤结构组成也较为相似,在真皮层下都有一层较厚的脂肪层,滇蛙脂肪层厚度约为真皮层厚度的1.52倍,仙琴蛙脂肪层厚度约为真皮层的1.60倍;阔褶蛙与沼蛙背侧褶基本结构也与其常规皮肤一致,且背侧褶结构组成也较为相似,阔褶蛙及沼蛙真皮层内具有单层排列、集中分布的大型特化颗粒腺,其分泌物为两种颗粒物的混合物。3）蛙科中两种背侧褶结构类型代表了两个进化方向,其功能分别为能量储存和反捕,推测其与环境适应进化相关。