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黄国存 张寒霜 高鹏 李俊兰 朱生伟 孙敬三HUANG Guo-cun ZHANG Han-shuang GAO Peng LI Jun-lan ZHU Sheng-wei SUN Jing-san 《遗传》2001,23(2):131-200
以绿色荧光蛋白GFP基因为报道基因,用花粉管通道和农杆菌介导的转化方法将外源基因导入棉花(Gossypium hirsutumL.),分别获得转化幼胚、幼苗和转化愈伤组织。用手持紫外灯结合显微镜检术能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定,比用GUS检测方法有明显的优越性。本研究不但为花粉管通道转化法的可行性提供了新的证据,同时也建立了GFP用于棉花基因工程研究的检测技术体系。
Abstract:With the Green Fluorescent Protein gene (GFP) as a reporter gene, the transgenic embryos, seedlings and calli of cotton(Gossypium hirsutum L.) were obtained by the method of pollen tube pathway and Agrobacterium-mediated techniques separately. The GFP gene under the control of the 35s Cauliflower Mosaic Virus promoter produced bright?green fluorescence easily detectable and screenable in cotton tissue by fluorescence microscopy and a hand-held ultraviolet lamp. The screenable marker aided and facilated the rapid segregation of individual transformation events, drastically reduced the quantity of tissue to be handled. The GFP can be screened in vivo without destroying the materials, so it is more practical and useful than GUS. The use of GFP could advance the development of cotton gene engineering. 相似文献
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绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究 总被引:6,自引:1,他引:6
本研究中 ,构建了含有编码绿色荧光蛋白的改进型基因质粒pJPM5。用基因枪法分别把pJPM5和另一带有绿色荧光蛋白基因的质粒pSBG70 0转入水稻TNG6 7愈伤组织。用South ern杂交法证实了转基因的存在 ,而且表明多数转基因植株含有 1到 8个拷贝的转基因。取 2个月的转基因植株上的叶片用于分析绿色荧光蛋白基因表达。用SLM - 80 0 0荧光分析仪定量测定绿色荧光蛋白。多数转基因植株具有很高的绿色荧光蛋白信号。虽然水稻植株有少量自发荧光 ,但是绿色荧光蛋白基因表达出的绿色荧光蛋白信号比植株的自发荧光强得多 ,其测定不会受自发荧光的太大影响。在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达。借助观察分析绿色荧光蛋白基因的瞬时表达 ,本研究还发现基因枪法转化中 ,如果两枪的气压为90 0psi& 135 0psi,比两枪的气压都为 90 0psi或者 135 0psi更好 ,因其能使质粒进入更多的细胞。研究结果表明 ,绿色荧光蛋白基因可以作为水稻 (甚至小麦、玉米 )转基因研究中的报告基因。研究还显示 ,MAR序列能明显增强绿色荧光蛋白基因的表达能力 (这一结果在另文讨论 ) . 相似文献
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绿色荧光蛋白(GFP)在真菌研究中的应用 总被引:5,自引:0,他引:5
绿色荧光蛋白(gteen fluorescent protein,GFP)来源于海洋生物水母(Aequorea victoria),由于其具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等无可比拟的优点,以GFP为报告基因已经被广泛地应用于真菌的分子生物学研究中。GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等;GFP基因通过与目标基因融合的方法,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究。 相似文献
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绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用 总被引:10,自引:1,他引:10
绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequoreavictoria)体内的一种发光蛋白,分子量27kD,由238个氨基酸组成。该蛋白65~67位SerTyrGly三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。野生型GFP发光较弱,而且gfpcDNA含有隐蔽型剪切位点,而加工改造的GFP在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号。GFP作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于植物研究之中。 相似文献
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绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(Aequorea victoria)体内的一种发光蛋白,分子量27kD,由238个氨基酸组成。该蛋白65~67位Ser-Tyr-Gly三种氨基酸环化加氧形成特殊的生色团结构。野生型GFP发光较弱,而且gfp-cDNA含有隐蔽型剪切位点,而加工改造的GFP在植物中能够正常表达并且加强了荧光信号。GFP作为新的报告基因和遗传标记被广泛应用于植物研究之中。 相似文献
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天麻抗真菌蛋白基因(gafp)转化彩色棉的研究 总被引:8,自引:0,他引:8
天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein简称GAFP)是从我国传统中药天麻(Gastrodia elata B1.)中分离到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病包括棉花枯萎病、黄萎病等的致病菌离体具有很强的抑制作用,因此,在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。本研究通过花粉管通道法,将GAFP的基因.gafp转入3个新疆彩色棉品种中,通过田间抗病筛选和分子检测,得到了高抗黄萎病的转基因植株,两株Southem杂交阳性植株LB-5-8和ZB-1—49对黄萎病表现整株免疫。RT-PCR的结果显示,LB-5-8和ZB-1—49中均有gafp的正确转录;离体的抑菌实验也表明,它们的蛋白粗提物对棉花黄萎病致病菌离体有明显的抑制,表明了gafp在转基因植株中的正确表达,翻译的产物具有活性。经过进一步选育和扩繁,发现转基因彩色棉后代具有稳定的、较强的抗黄萎病能力,本研究为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花黄萎病提供了一条新的途径。 相似文献
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转SCaM—GFP融合基因烟草中钙调素分泌特性的研究 总被引:5,自引:0,他引:5
钙调素是一种重要的Ca2 结合蛋白 ,在细胞内发挥着重要的生物学功能。一系列实验证实 ,钙调素也普遍存在于动植物细胞外[1- 3 ] ,并且具有重要的生物学功能[4 - 6] 。我们实验室的研究表明 :胞内外钙调素在Ca2 依赖性以及在靶酶激活特性等方面基本相同 ,但在Ca2 亲合力等方面存在差异[2 ,7] 。近年来 ,在植物细胞中发现存在多种钙调素亚型 ,特别是在大豆中对钙调素亚型研究得比较清楚[8] 。通过对大豆中钙调素亚型亚细胞定位的研究 ,一方面可以阐明钙调素是否具有向胞外主动分泌的特性 ,另一方面可以确定向细胞外分泌的钙调素是… 相似文献
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用电激法将GFP基因成功转入分离的小麦(Triticum aestivumL.)合子及早期原胚中。在电场强度150V/cm,电容25μF。线性DNA浓度200μg/mL,电激缓冲液pH7.2的条件下,得到GFP基因在早期原胚中的高频瞬间表达(46.7%)。与开花后5d胚胎的最适电场强度相比,合子和早期原胚因较幼嫩而最适电场强度较低。电激后的一些早期原胚可以在KM8p培养基中培养并继续分裂,分裂后的细胞中也能观察到GFP基因的表达。此外,电激后的合子及2细胞。4细胞和8细胞原胚中没有看到基因表达的嵌合现象。 相似文献
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目的:将绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)重组到胡萝卜愈伤组织细胞中,使其获得表达,为今后利用GFP基因作为植物报告基因提供条件。方法:通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体PBI1121转入到根癌农杆菌EHA105中,再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中,经过除菌和抗性筛选后观测转化结果。结果:荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光,利用PCR法扩增出约740bp的目的基因片断。结论:GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达。 相似文献
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gfp基因标记的重组杆状病毒对棉铃虫幼虫的侵染历程 总被引:6,自引:0,他引:6
用携带杆状病毒极晚期多角体蛋白基因启动子驱动gfp表达的重组病毒rHa FGP感染棉铃虫三龄幼虫 .在感染后不同时间取样 ,分离不同组织 ,制片 ,置于倒置荧光显微镜下观察基因的表达 .结果发现 ,随着感染时间的推移 ,荧光产生的部位出现更替 ,随后荧光强度也发生相应的变化 .从荧光出现的先后初步推断出杆状病毒对昆虫幼虫的侵染路线 :中肠上皮→血淋巴→气管系统→脂肪体 真皮 .在幼虫感染后 12h荧光即出现于中肠细胞中 ,表明此时已有极晚期蛋白表达 .说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 (cry)表达 ,从而提高杆状病毒的杀虫毒力是可行的 相似文献
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绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用 总被引:5,自引:0,他引:5
荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来 ,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP ,来源于水母 )具有独特的应用价值。在活体研究中 ,GFP相对于其它报告蛋白 (如 β 半乳糖苷酶 )在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾 ,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论 ,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。 相似文献
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绿色荧光蛋白及其应用 总被引:1,自引:0,他引:1
许多海洋无脊椎动物体内都含有绿色荧光蛋白,这种蛋白质结构很特殊,在受到激发时可以发射绿色或蓝色荧光。虽然对它的研究从本世纪六十年代才开始,但是它独特的性质逐渐引起了生物学界的广泛关注。本文将就绿色荧光蛋白的结构、性质及其应用前景作一综述。 相似文献
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Shun-lin HU Qin SUN Qu-zhi WANG Yu-liang LIU Yan-tao WU Xiu-fan LIU 《Virologica Sinica》2007,22(1):34-40
Based on the complete genome sequence of Newcastle disease virus (NDV) ZJI strain, seven pairs of primers were designed to amplify a cDNA fragment for constructing the plasmid pNDV/ZJI, which contained the full-length cDNA of the NDV ZJI strain. The pNDV/ZJI, with three helper plasmids, pCIneoNP, pCIneoP and pCIneoL, were then cotransfected into BSR-T7/5 cells expressing T7 RNA polymerase. After inoculation of the transfected cell culture supernatant into embryonated chicken eggs from specific-pathogen-free (SPF) flock, an infectious NDV ZJI strain was successfully rescued. Green fluorescent protein (GFP) gene was amplified and inserted into the NDV full-length cDNA to generate a GFP-tagged recombinant plasmid pNDV/ZJIGFP. After cotransfection of the resultant plasmid and the three support plasmids into BSR-T7/5 cells, the recombinant NDV, NDV/ZJIGFP, was rescued. Specific green fluorescence was observed in BSR-T7/5 and chicken embryo fibroblast (CEF) cells 48h post-infection, indicating that the GFP gene was expressed at a relatively high level. NDV/ZJIGFP was inoculated into 10-day-old SPF chickens by oculonasal route. Four days post-infection, strong green fluorescence could be detected in the kidneys and tracheae, indicating that the recombinant GFP-tagged NDV could be a very useful tool for analysis of NDV dissemination and pathogenesis. 相似文献
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Green fluorescent protein (GFP) and its homologs are widely used as fluorescent markers of gene expression and for determination of protein localization and motility in living cells. In particular, based on GFP and GFP-like proteins a number of techniques have been developed that can be used either to estimate protein mobility in living cells, or to introduce a distinctive fluorescent signal in order to track the movement of labeled molecules directly. Considerable progress in the development of such technologies in the last two or three years motivates us to reevaluate the present scope of biotechnological instruments in studies of protein movement in cells. 相似文献
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利用绿色荧光蛋白基因gfp研究芽胞杆菌的启动子活性 总被引:3,自引:3,他引:3
利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3,分别标记苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的cry3A启动子Pcry3A、BtI_BtII启动子PBtI_BtII和来自蜡状芽胞杆菌特异启动子P44-12以研究其表达差异。其中,Pcry3A和PBtI_BtII分别与gfpmut3构成融合基因,以调控gfpmut3在苏云金芽胞杆菌中的表达。将重组质粒pGFP_304(含P44-12)、pGFPExpA(含Pcry3A_ gfpmut3融合基因)和pGFPExpB(含PBtI_BtII_ gfpmut3融合基因)分别导入大肠杆菌(Escherichia coli)和苏云金芽胞杆菌后发现,P44-12和PBtI_BtII在大肠杆菌与苏云金芽胞杆菌中均可表达gfpmut3,其中PBtI_BtII在大肠杆菌中具有极强的启动基因表达的能力。而Pcry3A不能启动gfpmut3在大肠杆菌中表达,在苏云金芽胞杆菌中启动的gfpmut3表达的荧光强度也较弱。进一步通过荧光显微镜和生物活性检测器对含重组质粒pGFP_304、pGFPExpA和pGFPExpB的转化子分别进行荧光检测及微量热检测。结果表明,3种启动子驱动下的gfpmut3基因均可在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中表达并检测得到不同的发光类型。微量热法检测发现P44_12和PBtI_BtII启动gfpmut3表达的代谢热低于Pcry3A驱动gfpmut3表达的代谢热。 相似文献