琥珀酸脱氢酶的研究 Ⅱ.酶与辅基性质的进一步观察

(一)用结晶胰蛋白酶及结晶胰凝乳蛋白酶处理净化的水溶性琥珀酸脱氢酶,经过对甲酚抽提,硫酸汞沉淀,硫化氢分解及纸电泳纸层析等方法净化得到四种带有不同肽链的腺嘌呤异咯嗪核苷酸。从它们的组成成份的分析以及它们的性质的观察,我们认为它们与已知的腺嘌呤异咯嗪二核苷酸略有不同。肽链是连接在异咯嗪上,其连接方式异于一般异咯嗪蛋白。肽链部份的氨基酸组成的分析结果,证明它们都含有半胱氨酸。(二)琥珀酸脱氢酶中的铁处于还原状态。铁与酶朊紧密结合,它与酶活力有密切关系。(三)无机磷可增加琥珀酸脱氢酶的活力,但琥珀酸脱氰酶的活力并不是必需依靠无机磷的存在,乙二胺四乙酸与丙氨酸也有类似无机磷的作用。     

血红素与异咯嗪单核苷酸的分子络合物

血红素与FMN反应后的差光谱在500mμ—800mμ范围内有三个差吸收峰,波长分别为525mμ,610mμ及685mμ。用所谓连续变易法作图结果表明反应产物包括:血红素比FMN等于1:1,1:2及1:4等三种络合物,结合紧密程度依次降低。老化血红素与FMN反应只能产生1:1的络合物,表现出一个差吸收峰(585mμ)在过量连二亚硫酸钠存在下差光谱形状略为不同,血红素及FMN皆为全还原型时,络合物络合能力降低一个数量级。在隔绝空气的条件下逐步加入还原剂可以观察到在二者未完全还原前可能尚有其他络合物的生成。无论血红素是否经过老化它与FMN络合生成的产物差光谱皆受溶液离子强度的影响。对血红素与FMN络合的物质进行了讨论,所生成的某些络合物很可能是属于所谓电荷转移形式。这两种生物氧化中重要辅基如生成电荷转移络合物,可能与呼吸链中的电子传递有密切关系。     

琥珀酸脱氢酶的研究——琥珀酸脱氢酶还原细胞色素c的性质

新鲜制备之水溶性琥珀酸脱氢酶能还原细胞色素c,此还原细胞色素c之能力与其重组琥珀酸氧化酶系的能力呈平行关系,二者均很快减弱,数小时之内即全部丧失。还原细胞色素c之能力受金属螯合剂如邻二氮菲,硫茂甲酰基三氟丙酮及组氨酸等试剂的抑制,抗霉素A对它则无影响。除了能还原细胞色素c之外,其他如氮蓝四唑、2,6-二氯酚靛酚均可作为受体,并且亦很快失活。泛醌-5不能被还原,以其他受体测活力时,泛醌-5亦无激活作用。经分析,其异咯嗪、非血红素铁以及不稳定硫之比为1:(8～10):10。     

琥珀酸脱氢酶的研究——琥珀酸脱氢酶还原细胞色素c的性质

新鲜制备之水溶性琥珀酸脱氢酶能还原细胞色素c,此还原细胞色素c 之能力与其重组琥珀酸氧化酶系的能力呈平行关系,二者均很快减弱,数小时之内即全部丧失。还原细胞色素c 之能力受金属螯合剂如邻二氮菲,硫茂甲酰基三氟丙酮及组氨酸等试剂的抑制,抗霉素A 对它则无影响。除了能还原细胞色素c 之外,其他如氮蓝四唑、2,6-二氯酚靛酚均可作为受体,并且亦很快失活。泛醌-5不能被还原,以其他受体测活力时,泛醌-5亦无激活作用。经分析,其异咯嗪、非血红素铁以及不稳定硫之比为1∶(8～10)∶10。     

钉螺柠檬酸代谢酶系及琥珀酸脱氢酶的初步研究

应用比色法测得钉螺体内有柠檬酸缩合酶、顺乌头酸酶及异柠檬酸酶的活力。新杀螺剂溴乙酰胺作用后,钉螺的柠檬酸缩合酶活力减低26％,而对顺乌头酸酶及异柠檬酸酶无影响。体外试验丙二酸及二乙基二硫代氨基甲酸钠都可抑制钉螺琥珀酸脱氢酶,而钉螺在后者2ppm的溶液中浸泡48小时,有90—100％的死亡。     

琥珀酸脱氢酶的研究Ⅰ.分离、提纯及性质

琥珀酸脱氢酶的性质,辅基以及它与细胞色素系统的联系等问题,在近些年来有很多的争论。Bach,Dixon与Zerfas;Ball,Anfinsen与Cooper,以及Pappenheimer与Hendee等人的意见认为琥珀酸脱氢酶等于细胞色素b。本文作者之一在用氰化物使琥珀酸脱氢酶失效作用的试验中说明它与细胞色素b并不相同。Chance用完全不同的实验方法也得到了同样的结论。Axelrod,Potter与Elvehjem用缺乏核黄素     

琥珀酸脱氢酶的固定化及稳定性研究

琥珀酸脱氢酶(SDH)在细胞内是位于线粒体内膜上的酶,在呼吸链电子传递酶系中是一重要的环节。早在1955年,我国王、邹、汪等已将SDH从膜上拆离纯化,并进行了性质研究。酶从膜上分离后很不稳定,特别是当暴露在空气中,失活更为迅速。我们试图用已知结构的人工载体将SDH固定化,并观察固定化对酶稳定性的影响。本文报道这方面研究的初步结果。     

琥珀酸脱氢酶的x光光谱研究

使用同步辐射光源,以荧光模式研究了琥珀脱氢酶的X光吸收光谱,表明所含的铁硫蛋白中,铁处于硫的四面体配位中;由氧化态及还原态的铁K边化学位移大小可知每个铁原子得失电子个数,SDHu(A)为0.39,,SDH(I)为0.30,,都比1小得多;表明有配位体容纳电子的作用,也表明有重组活性的SDH(A),具有较强的接受电子能力.文中引用量子化学计算结果对光谱现象予以合理的解释.     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合

1.从正丁醇抽提琥珀酸脱氢酶的pH曲线说明它与内膜结合的pK值为8.7;正丁醇的浓度有一临界值在3℃时约为8%;从抽提的温度曲线说明琥珀酸脱氢酶与内膜通过离子键结合的解离活化热甚低而通过疏水键结合的解离活化热在11℃以上时为26,000卡左右;抽提量与醇碳链长短没有直接关系。2.盐类如氯化钾、氯化钠抑制水溶性琥珀酸脱氢酶与碱处理心肌制剂的重组,醇类及非离子型去污剂则促进重组达130%左右,除了促进重组外,它们还明显地激活重组后的琥珀酸脱氢酶把电子递给细胞色素c的能力。3.硫茂甲酰基三氟丙酮(以下简称TTFA)对心肌制剂琥珀酸-细胞色素c还原酶活力的抑制作用受pH的影响。根据抑制百分数的pH曲线求得的pK值在5～10℃时约为8.5。4.通过以上三方面的实验结果说明琥珀酸脱氢酶主要以离子键与线粒体内膜结合而疏水键則起着辅助的作用。     

枯草杆菌及大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

对枯草杆菌异柠檬酸脱氢酶（BsIDH）、大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶（EcIDH）和大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶的突变体酶（EmIDH）进行了纯化和酶学性质鉴定。BsIDH和EcIDH对辅酶NADP^＋的特异性与NAD^＋相比,分别是NAD^＋的1330倍和3890倍。而EmIDH对NAD^＋的特异性与NADP^＋相比,是NADP^＋的122倍。因此BsIDH和EcIDH是NADP^＋依赖性异柠檬酸脱氢酶,而EmIDH的辅酶特异性已转换为NAD^＋依赖性。EcIDH、BsIDH和EmIDH对底物异柠檬酸的Km值分别为67.4 μmol/L、60.6 μmol/L和105.6 μmol/L。BsIDH和EcIDH的最适反应pH分别为8.2和8.0,EmIDH的最适pH为7.0。BsIDH和EmIDH的最适反应温度是45℃,EcIDH的最适温度为43℃。三种IDH的活性依赖于不同的二价金属离子的存在,Mn^2＋ 、Mg^2＋存在时酶活性最强,Cu^2＋ 、Ca^2＋ 、Zn^2＋和Ni2＋强烈抑制酶的活性。系统的酶学性质研究为深入认识IDH的催化与调节机制提供了更多依据。     

琥珀酸脱氢酶的研究——Ⅳ.若干螯合剂对重组合的作用

(一)观察了若干金属螫合剂对于SD与AHMP重组成琥珀酸氧化酶系的影响,发现它们都有明显的抑制作用。(二)粗氨酸与OP能抑制SD与AHMP的结合,而氰化钾不抑制它们的结合,但影响组成的琥珀酸细胞色素c还原酶系的电子传递。(三)从螯合剂对重组合的抑制作用可看出SD的铁在重组合中是有功用的。(四)SD与AHMP结合后,以正铁氰化钾为受体测出的琥珀酸脱氢酶活力较之结合前增加3—5倍。关于这有趣现象的原因曾加以讨论,但肯定的解释尚有待于进一步的研究。     

樟子松外生菌根中NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶的酶学性质研究

对褐环乳牛肝菌-樟子松菌根组织、樟子松根组织及褐环乳牛肝菌纯培养菌丝的异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)进行纯化和酶学性质鉴定。通过硫酸铵分级沉淀及葡聚糖凝胶层析纯化后的IDH进行SDS-PAGE电泳检测,并进行3种来源酶的酶学性质鉴定。菌根组织、根组织及真菌纯培养菌丝NADP-IDH对NADP+的Km值分别为10.7μmol/L、11.4μmol/L和22.1μmol/L;对异柠檬酸的Km值分别为71.7μmol/L、79.3μmol/L和87.8μmol/L。最适p H分别为8.2、8.0和7.5,略偏碱性。菌根IDH和根IDH的最适反应温度为45℃,真菌IDH的最适反应温度为42℃。3种IDH的活性依赖于不同的二价金属阳离子的存在,Mn2+、Mg2+存在时酶活性最强,Ca2+、Co2+、Cu2+和Zn2+对酶的活性有较强抑制作用。菌根真菌与樟子松形成外生菌根之后异柠檬酸脱氢酶的蛋白含量及酶活力都得到了提高。     

輔酶細胞色素還原酶系的研究——Ⅰ.還原輔酶Ⅰ与琥珀酸的同時氧化

(一)本報告提供了一個從輔酶Ⅰ,用酶還原法製備還原輔酶Ⅰ的方法。我們所製得的還原輔酶Ⅰ鈉鹽乾粉,可以在低温保存數月而不被氧化。 (二)與心肌製劑中顆粒相結合的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶系,和用乙醇抽出的水溶性的輔酶Ⅰ細胞色素還原酶的性質頗不相同。其中比較重要的不同點是對於細胞色素c的親力,前者遠大於後者,其米氏常數僅約為後者的十二分之一。 (三)用一心肌顆粒製劑作為材料,無論用氧或過量之細胞色素c作為氫受體,還原輔酶Ⅰ與琥珀酸同時氧化時的總速度,不等於二者分別氧化時速度之和,而僅等於其中氧化較快者單獨氧化時之速度。但如用[2,6]二氯靛酚作為氫受體時,二者共同氧化時之總速度完全等於二者分別氧化時速度的和。 (四)當用氧或過量之細胞色素c作為氫受體時,琥珀酸與還原輔酶Ⅰ能彼此互相抑制對方氧化的速度。有足夠的實驗材料說明,還原輔酶Ⅰ對於琥珀酸氧化的抑制,不是由於草醯乙酸聚集的緣故。 (五)如果在反應混合物中同時含有琥珀酸脫氫酶的專一抑制劑,丙二酸,則琥珀酸對於還原輔酶Ⅰ氧化作用的抑制即被解除。 (六)根據以上的實驗結果,可以認為,還原輔酶Ⅰ及琥珀酸先通過一個共同的因子與細胞色素c作用。這個共同的因子在一般情形之下,也是這兩個酶系統的速度限制因子。應該指出在我們的實驗中,並未使用任何可能影響酶系統結構的條件,因此我們的結果是在一個比較接近於生理狀態的情形之下獲得的。 (七)應該着重指出,從本報告的結果可以看到,一個用人為的方法從複雜酶系上溶解下來的酶的性質,有時並不能代表這個酶在有組織的酶系統中的真實情况。 (八)我們相信,本報告所說明的兩酶系競爭一個共同因子的一些現象,將为研究複雜酶系之間的相互關係,提供一個新的方法。     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合——泛醌的影响

猪心肌制剂经含水4%丙酮抽提除去泛醌(Q)及部分脂后,其琥珀酸细胞色素c 还原酶活力丧失,但在反应系统中添加Q 可恢复此活力。去Q 制剂再经碱处理除去琥珀酸脱氢酶后,与新鲜制备的水溶性琥珀酸脱氢酶重组,其重组活力,包括结合的琥珀酸脱氢酶和琥珀酸细胞色素还原酶活力,与正常重组(未去除Q 的)相比,结果相似,指出Q 对琥珀酸脱氢酶与膜的结合无明显的影响,脂环境也不是重要因素。     

琥珀酸脱氢酶与线粒体内膜的结合——泛醌的影响

猪心肌制剂经含水4%丙酮抽提除去泛醌(Q)及部分脂后,其琥珀酸细胞色素c还原酶活力丧失,但在反应系统中添加Q可恢复此活力。去Q制剂再经碱处理除去琥珀酸脱氢酶后,与新鲜制备的水溶性琥珀酸脱氢酶重组,其重组活力,包括结合的琥珀酸脱氢酶和琥珀酸细胞色素还原酶活力,与正常重组(未去除Q的)相比,结果相似,指出Q对琥珀酸脱氢酶与膜的结合无明显的影响,脂环境也不是重要因素。     

同工酶与玉米杂种优势研究 Ⅴ.亲本系同工酶“酶谱纯度”与杂种优势的关系

已有许多关于植物同工酶与产量优势的关系以及用此方法预测杂种优势的研究报道,近来又有人根据同工酶频率的变化研究轮回选择对玉米籽粒产量的影响。我们在同工酶与玉米杂种优势研究中,观察到有些玉米品种自交系内不同单株之间虽然已经达到了育种学的纯度,但酶谱仍有显著不同,这种差异我们称为“酶谱纯度”不纯。这种“酶谱纯度”不纯的现     

固氮酶铁钼辅基理化特性的研究

在紫外可见光谱区内,固氮酶铁钼辅基〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（１２）Ｓ_（１２））４－〕均无特征吸收峰,不含高柠檬酸盐。含双钼的铁硫簇〔（Ｍｏ_２Ｆｅ_（６～１２）Ｓ_（６～１２））~（１～４）－〕的电荷数、颜色与该金属簇中的亚铁量成对应关系,并都有较高的生物重组活性．