沉默BCAT1对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的:研究BCAT1在肺癌细胞A549的增殖、迁移及侵袭能力中的作用。方法:通过小干扰RNA(si RNA)沉默A549细胞中BCAT1的表达,细胞分为对照组(Con)、BCAT1基因沉默组(si RNA-BCAT1)和si RNA阴性对照组(si RNA-NC)。利用Western blot检测si RNA对BCAT1的沉默效果;划痕愈合实验检测沉默BCAT1后A549细胞迁移能力的改变;Transwell小室侵袭实验检测沉默BCAT1后A549细胞侵袭能力的变化;MTT实验检测沉默BCAT1对A549细胞增殖能力的影响。结果:与Con组相比,si RNA-BCAT1组的BCAT1蛋白表达明显降低(P0.05),细胞划痕愈合率明显降低(P0.05),能够穿膜的细胞数明显减少(P0.05),而Con组和si RNA-BCAT1组细胞的增殖能力比较差异无明显统计学意义(P0.05)。结论:沉默BCAT1抑制A549细胞的迁移和侵袭能力,而对其增殖能力无影响。     

miRNA-145-5p调控FMNL2基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响

摘要 目的：分析miRNA-145-5p调控形成素2（formin-like 2,FMNL2）基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响。方法：按照脂质体2000说明书对细胞进行转染miRNA-145-5p inhibitor及miRNA-145-5p mimics,按照实验设计,将其分为空白组、沉默组（miRNA-145-5p inhibitor）及过表达组（miRNA-145-5p mimics）。荧光定量PCR法检测miRNA-145-5p、FMNL2表达量,MTT检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Western blot法检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达量。结果：过表达组miRNA-145-5p、Bax蛋白表达量,凋亡率,细胞G0/G1比例高于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞增殖率,FMNL2表达量、MMP-13、β-catenin、Bcl-2、APC蛋白表达量低于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞迁移能力弱于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）。结论：miRNA-145-5p通过靶向调控FMNL2,作用于Wnt/β-catenin信号通路调控口腔鳞癌干细胞,进而抑制细胞增殖、迁移。     

甘草提取物通过调控miR-212-5p/BCL2L2 基因抑制甲状腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨甘草提取物GL-1对甲状腺肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法以10、20、30 μg/mL GL-1处理甲状腺肿瘤细胞CAL-62,或在CAL-62细胞中转染miR-212-5p mimics、anti-miR-212-5p、si-BCL2L2、pcDNA-BCL2L2。其中转染pcDNA-BCL2L2细胞并以30 μg/mL GL-1处理。噻唑蓝比色法 (MTT)检测CAL-62细胞增殖,Transwell小室法检测CAL-62细胞迁移和侵袭,实时定量PCR (qPCR)检测CAL-62细胞中miR-212-5p表达,Western blot检测相关蛋白Bcl-2样蛋白2 (BCL2L2)、细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)和基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)表达。生物学信息预测miR-212-5p的下游靶基因,双荧光素酶基因报告实验进一步验证。数据采用单因素方差分析、Tukey’s事后检验和t检验。结果与对照组相比,10、20、30 μg/mL浓度GL-1降低CAL-62细胞24、48、72 h的细胞活性 (P < 0.05),并呈剂量、时间依赖性。与对照组相比,10、20、30 μg/mL浓度GL-1干预后,CAL-62细胞侵袭数[(143.56±14.22)个、(100.32±10.23)个、(68.23±6.49)个比(189.65±15.23)个]、迁移数[(198.56±14.35)个、(141.35±12.58)个、(89.56±8.95)个比 (295.36±17.56)个]和BCL2L2蛋白表达量 (0.76±0.08、0.51±0.06、0.24±0.02比1.00±0.12)均降低 (P 均< 0.05),而miR-212-5p水平 (1.61±0.11、1.99±0.13、2.28±0.15比1.00±0.07)升高(P < 0.05),并呈剂量依赖性。过表达miR-212-5p和沉默BCL2L2表达在24、48、72 h时CAL-62细胞活性、细胞迁移数、侵袭数和Cyclin D1、MMP-2蛋白表达量降低 (P < 0.05)。生物学信息预测和双荧光素酶基因报告实验证实BCL2L2是miR-212-5p的靶基因。过表达miR-212-5p抑制BCL2L2蛋白水平,沉默miR-212-5p促进BCL2L2蛋白表达 (P < 0.05)。过表达BCL2L2可逆转GL-1对CAL-62细胞增殖、迁移、侵袭及Cyclin D1、MMP-2蛋白表达的抑制作用。结论 GL-1通过miR-212-5p/BCL2L2抑制甲状腺肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。     

EZH2通过抑制miR-608基因表达促进结肠癌细胞增殖

探讨EZH2对结肠癌细胞增殖调控作用以及具体作用机制。通过对结肠癌细胞系SW480以及HCT116进行EZH2基因沉默,以检测EZH2对结肠癌细胞的增殖调控作用。MTT检法测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期及荧光定量PCR检测周期相关基因Cyclin D1、P15、P21以及mi R-608的表达变化。si RNA转染后,结肠癌细胞中EZH2的表达明显下降(p0.001),细胞增殖受到明显抑制(p0.05,p0.01或p0.001);si RNA组与阴性对照相比,G_1期细胞比例增高,G_2/M、S期细胞相对减少,cyclin D基因表达下调(p0.01,p0.05),P15、P21表达上调(p0.01)。通过荧光定量PCR发现,结肠癌细胞增殖抑制基因mi R-608在EZH2基因沉默组表达量显著上调(p0.001)。萤光素酶活性测试结果表明,EZH2在SW480和HCT116细胞中直接调控miR-608的基因转录(p0.001)。此外,miR-608基因沉默阻断siEZH2对结肠癌细胞增殖的调控作用。本研究发现了EZH2对结肠癌细胞增殖的显著促进作用,其具体作用机制在于抑制miR-608基因表达。因此,EZH2可望成为结肠癌潜在的治疗靶标。     

多效生长因子通过JNK信号通路负调控Schlafen2基因表达

实验室前期研究发现,多效生长因子（pleiotrophin,PTN）基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞中Schlafen2 (Slfn2)基因高表达.为了探讨Ptn沉默诱导Slfn2基因表达可能涉及的信号通路,应用Western印迹检测外源性PTN因子（终浓度50 ng/μl）对Ptn沉默细胞JNK磷酸化水平的影响;应用Northern 印迹分别检测JNK和p38通路特异性抑制剂对Ptn沉默细胞Slfn2基因转录水平的影响.结果发现,Ptn沉默细胞内JNK磷酸化水平高于对照细胞,外源性PTN处理后沉默细胞内JNK磷酸化水平下调;阻断JNK通路呈时间依赖性抑制Ptn沉默细胞中Slfn2基因转录,阻断p38通路对Ptn沉默细胞中Slfn2转录水平没有明显影响结果提示,Ptn可能通过抑制其下游JNK/MAPK通路来负调控Slfn2的表达.     

miR-24-3p对宫颈癌细胞增殖与迁移的作用及机制研究

该文探讨了miR-24-3p对宫颈癌细胞增殖和迁移的促进作用及其机制。采用miR-24-3p抑制剂下调宫颈癌细胞中miR-24-3p的表达后,通过MTT、Transwell实验和Western blot检测细胞增殖、迁移和PCNA蛋白水平;采用生物信息学方法预测miR-24-3p的靶基因并进行功能注释和筛选;双荧光素酶报告实验和Western blot验证靶基因类血管动蛋白-2(angiomotin-like 2,AMOTL2),并通过siRNA抑制AMOTL2检测其对宫颈癌细胞迁移的影响。结果显示,下调miR-24-3p能抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力并减少PCNA蛋白表达;其靶基因主要存在细胞与细胞连接组分中,显著富集于蛋白激酶活性分子功能、蛋白质自身磷酸化生物学过程和癌症中microRNA信号通路;miR-24-3p能靶向负调控最佳靶基因AMOTL2,下调AMOTL2可促进宫颈癌细胞CaSki的迁移。总之,miR-24-3p可调控多靶基因参与多个生物学过程和多条信号通路,在宫颈癌中可促进细胞增殖且通过靶向AMOTL2促进迁移。     

p85a基因对人神经母细胞瘤SY5Y细胞迁移的影响

通过干扰p85a基因的表达,探讨其在人神经母细胞瘤SY5Y细胞迁移中的作用及对m RNA和蛋白质水平的影响。首先,构建p85a基因的干扰质粒si RNA质粒(si-p85a)和过表达质粒(OE-p85a),转染人神经母细胞瘤SY5Y细胞,48 h后,用定量PCR方法检测p85a基因的m RNA水平变化;Western blot检测其蛋白质水平变化;用流式细胞术检测细胞周期变化;随后,将si-p85a、OE-p85a等质粒转染12孔板中的细胞,分别在24、48、72 h时做划痕实验,观察细胞迁移的变化。定量PCR显示,与MOCK组相比,不同组p85a基因表达有差异。干扰质粒(si-p85a)组表达降低,约为对照组的0.42倍;而过表达(OE-p85a)组表达明显升高,为对照组的22.84倍,均有显著性统计学差异(P0.05)。Western blot结果显示,转染si-p85a质粒后,p85a蛋白质水平下降;而转染OE-p85a质粒,p85a蛋白质水平升高。划痕实验中,转染OE-p85a可促进SY5Y细胞迁移,转染si-p85a后抑制细胞迁移,均有统计学差异(P0.05)。实验结果表明,在SY5Y细胞生长过程中,p85a基因起到重要作用,可以促进SY5Y细胞迁移运动。     

Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究

目的:探讨核蛋白1(Nupr1)调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究。方法:肿瘤抑制剂盐酸素(salinomycin)不同时间处理非小细胞肺癌细胞A549后采用Western Blot法检测非小细胞肺癌细胞A549中Cleaved Caspase-3、Nupr1的蛋白表达;Transwell小室检测Nupr1基因沉默后非小细胞肺癌细胞A549细胞体外迁移、侵袭能力的变化;Western Blot法检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549 MMP-2、TIMP-1的蛋白表达;流式细胞仪检测Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549的凋亡情况。结果:与未经肿瘤抑制剂salinomycin处理对照组相比较,salinomycin处理后的非小细胞肺癌细胞A549中Nupr1蛋白表达量下降,Cleaved Caspase-3蛋白表达量升高,并且随着作用时间呈依赖关系。Nupr1-siRNA转染组的迁移能力相比对照组未转染组下降(64.4±7.2)%,Nupr1-siRNA转染组的侵袭能力相比对照组下降(58.7±7.3)%。与未转染Nupr1-siRNA对照组相比较,转染后TIMP-1的表达明显上调,而MMP-2的表达则明显下调。流式细胞仪检测结果显示Nupr1沉默后非小细胞肺癌细胞A549出现大量凋亡。结论:Nupr1基因沉默后通过上调TIMP-1的表达,下调MMP-2的表达降低肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力,进而促进非小细胞肺癌细胞凋亡。     

人髓样分化因子88的生物信息学分析

人髓样分化因子88(MyD88)属于Toll样受体和IL-1受体家族成员下游的炎症信号通路的中心因子。为了研究人MyD88的蛋白结构和功能,本文利用重要数据库进行了生物信息学分析。研究表明,人MyD88基因全长为5 670 bp,位于染色体3p22. 2,共编码296个氨基酸。人MyD88蛋白具有较高的保守性,其等电点为5. 64,不存在信号肽,并且含有2个苏木化位点、15个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点。该蛋白主要定位在细胞核和细胞质中,而且在血液、脾脏和肺较多,其二级结构含有145个α-螺旋和30个β-折叠,拉曼图表明三级结构模型A是可信的。与人MyD88相互作用的蛋白主要是Toll样受体和白介素相关蛋白,并且参与炎症反应、细胞凋亡等重要的免疫过程。本研究为阐明人MyD88基因结构特点和生物学功能奠定了理论基础,也为其相关疾病诊断和治疗提供了新思路。     

Sprouty-2对胃癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的影响

目的:研究Sprouty2(SPRY2)基因在胃癌肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)和侵袭转移的影响。方法:体外培养人胃癌细胞(BGC-823),采用慢病毒介导的sh RNA沉默SPRY2基因,并用实时定量PCR与Western blot检测其SPRY2、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的表达,采用细胞划痕实验、Transwell实验检测SPRY2基因沉默后的胃癌细胞侵袭转移能力变化。结果:在慢病毒介导sh RNA沉默SPRY2基因的人胃癌BGC-823细胞中,SPRY2的m RNA和蛋白表达明显降低(P0.05),SPRY2沉默后人胃癌细胞E-cadherin的蛋白表达增多(P0.05),vimentin的蛋白表达减少(P0.05)。此外,SPRY2沉默后,胃癌细胞迁移能力和侵袭能力明显减弱(P值均P0.05)。结论:Sprouty-2基因通过调节E-cadherin与vimentin的表达参与胃癌细胞的上皮-间质转化,进而促进胃癌细胞的迁移与侵袭。     

miR-31-3p对横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移的抑制作用和机制

该文研究了micro RNA-31-3p(mi R-31-3p)在横纹肌肉瘤细胞中的表达水平及其对细胞增殖和迁移的影响。通过定量RT-PCR法检测mi R-31-3p的表达水平。采用脂质体介导法将mi R-31-3p成熟体转染入横纹肌肉瘤细胞,通过MTS法、克隆形成实验、流式细胞技术和细胞功能分析仪分别检测细胞增殖能力、生长能力、周期和迁移能力。萤光素酶法和Western blot验证mi R-31-3p的靶基因。通过si RNA抑制STAT3检测其对横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移的影响。结果显示,横纹肌肉瘤细胞中mi R-31-3p的表达水平较正常横纹肌组织显著下调。上调横纹肌肉瘤细胞中的mi R-31-3p能显著抑制细胞的增殖、克隆形成和迁移能力,并诱导细胞周期发生G1期阻滞。萤光素酶和Western blot结果显示, STAT3为mi R-31-3p的靶基因。下调STAT3的表达水平能够显著抑制RD细胞的增殖和迁移能力。总之, miR-31-3p可能通过下调STAT3来抑制横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移。     

沉默EZH2基因表达对宫颈癌细胞增殖能力影响的分析

本实验旨在探讨EZH2基因在宫颈癌中表达情况、对宫颈癌细胞增殖能力的影响及其机制。通过免疫组织化学法检测20例正常宫颈、20例CIN及60例宫颈鳞癌组织中EZH2蛋白表达;采用RT-PCR法检测4个宫颈癌细胞株中EZH2 m RNA的表达。通过Lipofectamin2000介导EZH2 si RNA瞬时转染C33A细胞株,Western blotting法检测si RNA的干扰效率。MTT、流式细胞仪检测EZH2沉默后细胞增殖及细胞周期变化;Western blotting检测p21表达变化。结果显示,正常宫颈组织、CIN、宫颈鳞癌中EZH2阳性表达率分别为15%、30%、76.7%,呈逐级升高趋势,后者与前两者见差异有统计学意义(p0.01);EZH2的表达同宫颈鳞癌细胞分化程度、间质浸润深度及淋巴结转移显著相关(p0.05)。EZH2 m RNA在宫颈癌细胞株He La、Si Ha、C33A及Caski中均表达,其中C33A细胞中表达最高。si RNA沉默EZH2基因明显抑制宫颈癌C33A细胞增殖,阻滞细胞周期于G1期;Western blotting检测p21表达上调。由此得出结论,EZH2基因在宫颈癌中高表达;沉默EZH2基因可通过上调p21蛋白的表达阻滞细胞周期于G1期、抑制宫颈癌细胞的增殖。     

基质交联分子1表达下调对人胰腺癌SW1990细胞周期及细胞凋亡的影响

目的探讨基质交联分子1(STIM1)表达下调对人胰腺癌细胞株SW1990细胞周期和细胞凋亡的影响,并研究其分子作用机制。方法构建携带STIM1基因si RNA的慢病毒载体转染SW1990细胞,分为对照组、空载体组和STIM1组。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot验证STIM1组SW1990细胞STIM1表达下调。通过MTT增殖实验和流式细胞术检测STIM1表达下调对细胞增殖、周期和细胞凋亡的影响,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞周期和细胞凋亡相关分子表达的变化。两组间比较采用t检验。结果STIM1组SW1990细胞中STIM1表达mRNA(0.261±0.029)、蛋白(0.120±0.032)低于空载体组mRNA(1.002±0.091)、蛋白(0.996±0.053),t=20.74、26.89,P均0.01。SW1990细胞24、48、72 h的增殖水平STIM1组分别为(0.122±0.008)、(0.252±0.031)、(0.373±0.028),相比空载体组(0.223±0.035)、(0.618±0.017)、(0.924±0.140),t=6.48、16.90、23.99,P0.01,受到抑制。STIM1组中SW1990细胞G2/M期细胞比例(41.47±0.66)﹪高于空载体组(10.30±2.24)﹪,t=23.14,P0.01。STIM1组中SW1990细胞凋亡率(25.21±1.96)﹪高于空载体组(3.71±1.23)﹪,t=16.03,P0.01。半定量RT-PCR和Western blot提示,STIM1组细胞周期蛋白B1(cyclin B1)表达mRNA(0.344±0.031)、蛋白(0.776±0.042)相比空载体组mRNA(1.011±0.060)、蛋白(1.034±0.036),t=40.06、8.51,P均0.01下调;STIM1组p21表达mRNA(1.970±0.107)、蛋白(1.315±0.093)相比空载体组mRNA(1.025±0.044)、蛋白(0.998±0.036),t=17.10、9.52,P均0.01上调;STIM1组Bcl-2表达mRNA(0.156±0.025)、蛋白(0.381±0.028)相比空载体组mRNA(1.010±0.072)、蛋白(0.980±0.057),t=15.46、14.63,P均0.01下调;STIM1组survivin表达mRNA(0.188±0.022)、蛋白(0.022±0.019)相比空载体组mRNA(1.016±0.090)、蛋白(0.994±0.047)t=58.08、442.58,P均0.01下调;STMI1组procaspase-3表达蛋白(0.389±0.030)相比空载体组蛋白(1.008±0.040)下调,差异有统计学意义(t=19.22,P0.01)。结论在胰腺癌SW1990细胞中,沉默STM1可阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,有望成为胰腺癌治疗的分子靶点。     

MyD88aa155-171功能区缺失对免疫相关细胞共刺激分子和细胞因子表达的影响

利用重组PCR的方法,克隆并构建MyD88和MyD88aa155-171功能区缺失（MyD88?155-171）载体,转染免疫相关细胞并筛选获得稳定细胞系。报告基因实验结果显示MyD88?155-171功能区缺失能够抑制转录因子NF-κB和AP-1的活性,在不同Toll样受体（TLR）配体刺激后,转染MyD88?155-171的细胞表面分子的表达低于MyD88正常表达的细胞,并且抑制表面分子CD86和B7H1在TLR配体刺激后的上调。同时,多细胞因子分析系统的检测结果表明,给予TLR配体刺激之后,MyD88-/-树突细胞表达低水平的细胞因子,转染MyD88可以使细胞因子表达明显增加,而仅表达MyD88?155-171可以明显影响IL-12,IFN- 的表达。以上结果表明MyD88功能区缺失影响免疫相关细胞表面分子和细胞因子的表达及Toll 样受体信号的传递,其在细胞内信号系统的具体作用机制还需进一步证实。     

miR-340-5p及PDCD4在过表达乙肝病毒X蛋白的足细胞中的表达及生物学意义

乙肝病毒X蛋白(HBx)引起足细胞损伤与乙型肝炎相关性肾小球肾炎的发病有关,但具体的机制尚不清楚。miR‐340‐5p是受到HBx调控的miR,能够靶向细胞程序性死亡基因4(PDCD4)基因发挥神经元保护作用。本研究观察了过表达HBx的足细胞中miR‐340‐5p及PDCD4表达的变化及生物学意义。培养小鼠足细胞系MPC5后转染HBx质粒、miR‐340‐5p、si‐PDCD4,MTS法检测细胞增殖活力OD₄₉₀、TUNEL法检测细胞凋亡率、荧光定量PCR检测miR‐340‐5p的表达、Western blot检测PDCD4的表达、双荧光素酶报告基因实验验证miR‐340‐5p靶向PDCD4基因3’UTR。结果显示,与对照组比较,HBx组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD₄₉₀水平降低,PDCD4的表达、凋亡率增加;与HBx组比较,HBx+miR‐340‐5p组细胞中miR‐340‐5p的表达、OD₄₉₀水平增加,PDCD4的表达、凋亡率降低,HBx+si‐PDCD4组细胞中OD₄₉₀水平增加,...     

Janus激酶3通过影响钙池操纵性钙通道促进乳腺癌细胞的迁移北大核心CSCD

本研旨在探讨Janus激酶3 (JAK3)对乳腺癌细胞迁移能力的影响以及其作用机制。利用si RNA (si JAK3)沉默乳腺癌MCF-7细胞JAK3的表达,用划痕实验检测细胞迁移能力,用荧光钙成像技术检测钙池操纵性钙通道(store-operatedcalcium channel,SOCC)活性,用Westernblot和RT-PCR检测钙池操纵性钙内流(store-operatedcalciumentry,SOCE)过程中的重要分子Orai1和STIM1表达水平。结果显示,SOCC抑制剂2-APB对MCF-7细胞的迁移能力有抑制作用。si JAK3转染可显著抑制MCF-7细胞的迁移能力,降低SOCC活性,下调Orai1和STIM1的m RNA和蛋白表达水平。在JAK3沉默细胞中过表达Orai1或STIM1,可使MCF-7细胞迁移力恢复。上述结果提示,JAK3通过影响SOCC促进乳腺癌细胞的迁移。     

鸡髓样分化因子88的原核表达及单克隆抗体制备

目的:克隆、表达、纯化鸡髓样分化因子88(MyD88),制备其单克隆抗体。方法:从脾脏cDNA中扩增857bp的MyD88基因片段,插入pMAL-c5X表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析MBP(麦芽糖结合蛋白)-MyD88重组融合蛋白的表达,切胶纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备针对MyD88的单克隆抗体,Western印迹检测抗体特异性,制备腹水并进行抗体亚型鉴定和效价测定。结果:构建了鸡MyD88原核表达载体pMAL-MyD88,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在;建立了3株抗鸡MyD88单克隆抗体细胞株,制备了腹水,亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a,轻链均为κ,腹水抗体的效价均为1∶2×105。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组鸡MyD88,制备了针对鸡MyD88的单克隆抗体,为后续的MyD88定量和功能研究奠定了基础。     

SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制研究

该文旨在探讨慢病毒介导的沉默信息调节因子6(silent information regulator 6,SIRT6)基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响及其机制。逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot分别检测人肝癌细胞系(SK-Hep-1、Huh-7、PLC/PRF/5、Hep G2)和永生化肝细胞系(MIHA)中SIRT6基因的表达水平;利用慢病毒介导的sh RNA干扰技术靶向沉默SIRT6的表达,并通过RT-PCR和Western blot验证其沉默效率;流式细胞术检测SIRT6基因沉默对人肝癌细胞凋亡的影响,进一步应用RT-PCR和Western blot检测SIRT6基因沉默对凋亡抑制蛋白基因(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族m RNA和蛋白质水平的影响;最后,应用流式细胞术分析X连锁凋亡抑制蛋白基因(X-linked inhibitor of apoptosis protein gene,XIAP)在SIRT6基因沉默诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。结果显示,SIRT6基因在人肝癌细胞系中表达上调;慢病毒介导的sh RNA能抑制人肝癌细胞中SIRT6基因的表达;沉默SIRT6基因的表达能诱导人肝癌细胞凋亡,并降低XIAP的m RNA和蛋白质水平;过表达XIAP能逆转SIRT6基因沉默所诱导的人肝癌细胞凋亡。该研究结果提示,SIRT6基因沉默可能通过调节XIAP的表达从而诱导人肝癌细胞凋亡。     

Janus激酶3通过影响钙池操纵性钙通道促进乳腺癌细胞的迁移

本研旨在探讨Janus激酶3 (JAK3)对乳腺癌细胞迁移能力的影响以及其作用机制。利用si RNA (si JAK3)沉默乳腺癌MCF-7细胞JAK3的表达,用划痕实验检测细胞迁移能力,用荧光钙成像技术检测钙池操纵性钙通道(store-operatedcalcium channel,SOCC)活性,用Westernblot和RT-PCR检测钙池操纵性钙内流(store-operatedcalciumentry,SOCE)过程中的重要分子Orai1和STIM1表达水平。结果显示,SOCC抑制剂2-APB对MCF-7细胞的迁移能力有抑制作用。si JAK3转染可显著抑制MCF-7细胞的迁移能力,降低SOCC活性,下调Orai1和STIM1的m RNA和蛋白表达水平。在JAK3沉默细胞中过表达Orai1或STIM1,可使MCF-7细胞迁移力恢复。上述结果提示,JAK3通过影响SOCC促进乳腺癌细胞的迁移。     

p53基因表达沉默的稳定Vero细胞系的建立及特性分析

利用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立稳定沉默p53基因的Vero细胞模型。设计针对p53基因的shRNA序列,构建p53shRNA慢病毒载体并感染Vero细胞;嘌呤霉素筛选阳性细胞,局部消化法挑选细胞克隆;利用RT-PCR和West-ernblot检测p53的表达水平;利用虫荧光素酶报告系统,分析p53的转录激活功能。RT-PCR和Westernblot结果显示,慢病毒介导的shRNA有效地沉默p53基因表达;与对照组细胞相比,干扰组细胞的p53的转录激活功能明显降低。慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了p53基因的表达,同时,有效地降低了p53的转录激活功能,为研究p53的生物学功能提供了有利的工具。