Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用

Red同源重组技术发展迅速,已广泛应用于大肠杆菌基因组修饰,在点突变、基因敲除、序列整合等方面发挥着重要作用。简要综述了Red同源重组的重组机制和操作策略等研究进展,并介绍了Red同源重组在大肠杆菌基因组减小及多基因代谢途径优化方面的应用情况。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换.与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点.分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam 3种蛋白质的功能,Red重组系统运用于大肠杆菌基因敲除的3种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件.     

Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰的研究进展

Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换。与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点。本文分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam三种蛋白质的功能,Red重组系统运用在大肠杆菌基因敲除中的三种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件。     

Red同源重组技术研究进展

伴随着分子生物学的发展,一种基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统已应用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成:Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA的末端,从5′端向3′端降解DNA,产生3′突出端;Beta蛋白结合在单链DNA上,介导互补单链DNA退火;Gam蛋白可与RecBCD酶结合,抑制其降解外源DNA的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行,大大推动功能基因组研究的发展。     

利用同源重组的方法提高大肠杆菌W3110天冬氨酸的积累

大肠杆菌中存在3种天冬氨酸激酶,分别为LysC,MetL,ThrA,使天冬氨酸磷酸化后分别进入Lys、Met、Thr的合成途径.因此大肠杆菌菌体中无法积累大量天冬氨酸. 以大肠杆菌W3110为出发菌株,利用Red同源重组系统分别构建了LysC、ThrA和MetL单基因缺陷株和LysC-ThrA和LysC-MetL双基因缺陷株. 采用高效液相色谱法测定L-天冬氨酸积累量. 发现除MetL单基因突变株外,其余突变株均积累了比野生型更多的L-天冬氨酸,这为代谢工程改造菌株并通过发酵法生产天冬氨酸奠定了基础.     

Red重组技术研究进展

主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red 重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术,指出了其中的缺陷。然后提出了Red重组技术的定义：利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法,外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片断等,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除

利用EL350基因工程菌进行同源重组, 成功进行基因敲除已有报道, 但利用该系统进行乳腺生物反应器质粒构建的研究却未见报道。实验采用含有完整的牛b 酪蛋白基因的CSN2质粒作为基因打靶的载体, 设计不同的同源臂, 成功地敲除了b 酪蛋白基因的编码区。并且同时利用同源重组技术对敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。为进一步利用CSN2质粒两端的调控序列, 插入新的基因, 研究其表达功能, 或者进行乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

Red同源重组敲除nagE和manX对大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响?

氨基葡萄糖(GlcN)又称氨基葡糖或葡糖胺,是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物,在医药和保健领域具有广泛应用。在前期研究中,我们构建了一株可高效合成GlcN和其乙酰化衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的重组大肠肝菌Escherichia coli-glms-gna1(在下游提取过程中用弱酸进行脱乙酰化即可将GlcNAc转化为GlcN)。但研究发现,发酵过程中GlcN和GlcNAc能被转运至胞内作为碳源利用,导致胞外产量显著减少。为阻断胞外GlcN和GlcNAc向胞内的转运,利用Red同源重组技术将E.coli-glms-gna1的乙酰氨基葡萄糖磷酸转运子编码基因nagE和甘露糖磷酸转运子编码基因manX敲除,获得nagE基因敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE和nagE/manX基因双敲除的工程菌E.coli-glms-gna1-nagE-manX,并在7 L发酵罐上利用构建的工程菌进行GlcN和GlcNAc的发酵生产。实验结果表明:培养对照菌株E.coli-glms-gna1至12 h时GlcN产量达到最大值4.06 g/L,GlcNAc产量达到最大值41.46 g/L;而培养单基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE至12 h时GlcN产量达到最大值4.38 g/L(是对照菌株的1.08倍),GlcNAc产量达到最大值71.80 g/L(是对照菌株的1.7倍);培养双基因敲除菌株E.coli-glms-gna1-nagE-manX至10 h时GlcN产量达到最大值4.82 g/L(是对照菌株的1.2倍),GlcNAc产量达到最大值118.78 g/L(是对照菌株的2.86倍)。这表明nagE和manX基因的敲除可显著降低GlcN和GlcNAc向胞内的转运,进而提高其在胞外的积累。研究结果对最终实现GlcN的工业化生产具有一定的指导意义。     

利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。本实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47Kb无启动子的HPRT基因组片段（不含有第1个外显子）克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于本实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。     

Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。此实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。     

A novel method for gene-targeting vector construction—Red/ET recombination

The study of the function of novel human genes has become an increasingly active academic field with the gene-knockout (KO) mouse model forming the basis of this study. Because of the low efficiency of recombination of targeting vector constructed using the traditional method, the KO mouse model has become the key step in the construction of a targeting vectors, both economically and efficiently. To study the function of a novel gene (Resp18), a novel DNA engineering platform, Red/ET recombination, was introduced to construct the Resp18 targeting vector. Red/ET recombineering differs from the conventional methods of vector construction (e.g., PCR, restriction enzyme digestion, and ligation), and genetic modification is accomplished by acquisition, insertion, fusion, or replacement of the target gene through small fragments-mediated homologous recombination. At present, Resp18 targeting vectors constructed using three strategies mentioned above were successfully released through two homologous recombination processes of retrieval and neo-targeting. Red/ET recombination has the advantage of producing genes with longer homology regions without mutation.     

基因敲除提高大肠杆菌工程菌生产异丁醇产量的研究

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。     

应用细菌内同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究

以犬2型腺病毒为载体进行疫苗和基因治疗的研究,是近年的研究热点.目前的焦点问题是新型载体的构建,经典的方法是体外连接,费时、费力.     

基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法

快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组系统结合Xer重组系统删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的ackA-pta基因和pps基因。实验证明了可重复应用dif位点实现大肠杆菌染色体上多基因突变的叠加,同时,在染色体上并未留下抗生素标记,借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。此外,本方法重组效率高,实验步骤较简便。     

应用细菌内同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究

A novel procedure was used for cloning large adenovirus genome fragment by the homologous recombination in E.coli strain BJ5183. The 11.2Kb downstream fragment of the CAV-2 strain YCA18 genome was cloned by homologous recombination, the 1029bp left end and the 970bp fight end of this fragment were separately amplified by PCR. They were then cloned into plasmid pPoly2 with direction from left fragment to fight fragment, obtaining a “rescue” plasmid pT615. The pT615 was liberalized by Hind Ⅲ and PstⅠ digestion and was cotransformed with the purified CAV-2 genome which was cut by BstBI into competent E.coli strain BJ5183. Recombinant plasmids harboring the 11.2Kb downstream fragment of CAV-2 genome were obtained after bacterial intermolecular homologous recombination. The recombinant efficiency of all E.coli strains tested was 78.3%. One of the recombinant plasmids, pT618, was further identified by enzyme digestion analysis and PCR amplification. The results showed the plasmids contained the 11.2kb fragment downstream the genome of CAV-2.