牛痘病毒对发展新疫苗的作用

<正> 重组DNA技术、肽化学和免疫学的进展为开发新疫苗提供了有力的工具。而完成这些工作还依赖于体液免疫和细胞免疫靶子的鉴别及它们在保护机体中所起作用的评价。由于牛痘病毒可以作为载体表达外源基因,对有效靶抗原的测定具有重要作用。牛痘病毒基因表达水平的提高使得在哺乳类细胞中繁殖牛痘病毒而制备蛋白亚单位疫苗成为可能。能否用重组牛痘病毒作为一种活疫苗,即象消灭天花所使用的牛痘疫苗那样应用,仍是目前争论的焦点。 重组牛痘病毒构建 牛痘病毒基因组约为20万碱基对,具有单一调控序列的病毒编码转录系统,无RNA     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

一种表达人T淋巴细胞病毒Ⅲ型包膜基因的牛痘病毒重组体

<正>含有完整HTLV—Ⅲ env基因的DNA片段,它们起始于推定的翻译起始密码子,或起始于该密码子前方706bp处,这些DNA片段被置于牛痘病毒启动区控制之下。以其胸腺核苷激酶阴性(TK~-)表型为基础,挑选牛痘病毒重组体的蚀斑法,借助加到琼脂糖覆盖层中的指示剂鉴定表达的β—半乳糖苷酶而形成兰色。用聚丙烯酰胺凝胶电泳法证明,纯化的重组牛头病毒V25和V26感染     

腺病毒4型和7型重组乙肝疫苗在犬体内的免疫效果

<正>近年来,应用感染性哺乳动物病毒载体,特别是腺病毒(Ad)和牛痘病毒,作为有潜能的疫苗,日益受到重视。腺病毒尤其受人青睐,有下列原因: 1.腺病毒感染产生的大量腺病毒蛋白有助于异源基因的高水平表达。 2.切去无意义的E_3区,可供插入大片段的外源基因,以建立有活力的不依赖辅助物的腺病毒载体。     

表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制

以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中。用含有MDV-US2区50bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。     

关于艾滋病疫苗研究在技术和政策上的进展

虽然对艾滋病还没有有效的治疗方法和好的疫苗,但在有关的技术和政策上已有一些改进。两个研究小组分别使用重组体牛痘病毒表达了艾滋病病毒的包膜基因。一个小组是由国家变应性和传染性疾病(NIAD)研究所和国家的癌症研究所(NCI)的人员组成。他们来自 HTLV-Ⅲ的全部 env 蛋白质基因组入牛痘病毒中。不仅是真正的合成蛋白质,而且从艾滋病病人的血清中都能识别 env 蛋白。不但如此,把传染性的牛痘病毒给小鼠只注射一次,     

植物病毒表达载体研究进展

利用DNA或RNA植物病毒作载体表达外源蛋白是近几年发展较快的一种新的遗传转化方式,它具有以下几个优点:表达量大,表达速度快,易于进行基因操作和接种以及适用对象广泛。已发展的四种载体构建策略包括:基因取代,基因插入,融合抗原和基因互补。植物病毒表达载体可以用于基因的重组、病毒的移动和基因功能的检测等基础性研究,也可用于商业上表达多种药用蛋白或疫苗。植物病毒表达载体的稳定性主要取决于存在同源序列而引起的基因重组。本文还对病毒载体的生物安全性进行了讨论。     

Pri-miRNA21/23a重组病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的:构建Pri-miRNA-21/23A基因的重组病毒载体,并在L-02肝细胞中获得表达。方法:设计并合成Pri-miRNA-21/23a的基因产物,插入含绿色荧光蛋白Zsgreen基因的真核表达载体pCI Mamma Lian中,以重组质粒为模板,设计扩增含Zsgreen基因的Pri-miRNA序列产物,并将其与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接,将Pri-miRNA重组病毒载体转染293T细胞后进行病毒包装,病毒上清转染L-02肝细胞后用荧光显微镜及实时荧光定量PCR确认转染效果。结果:荧光定量PCR结果显示重组病毒上清转染L-02肝细胞感染效果良好,经荧光显微镜观察,证实重组病毒载体能在细胞中表达蛋白。结论:构建了Pri-miRNA21/23a重组病毒表达载体并在L-02肝细胞中表达,奠定了miRNA进一步功能研究的基础。     

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法,对HPV581L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰,并保留氨基酸不变.选用非复制型重组痘苗病毒为载体,将修饰的L1基因1.5kb和L2基因1.4kb分别插入痘苗病毒表达载体pJSD的7.5k和H6早期启动子之后,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组.经单斑筛选纯化,获得共表达HPV58L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株.该病毒在CEF细胞上连续传至第15代,经斑点杂交分析,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入;经Western blot检测,重组病毒能稳定表达HPV581L1及L2蛋白.此结果为HPV58型非复制型重组痘苗病毒疫苗人用株的研究打下了基础.     

表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组非复制型痘苗病毒的构建及鉴定

目的:以非复制型痘苗病毒天坛株为载体表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),并体外鉴定其生物学活性。方法:构建含有小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒质粒,与非复制型痘苗病毒进行同源重组,筛选表达小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ,对目的基因及蛋白的表达进行鉴定,并在体外检测目的蛋白的生物学活性。结果:构建的重组病毒rNTVGMCSFLacZ中正确插入了小鼠GM-CSF基因,Western印迹结果表明其能正确表达GM-CSF,且在体外证明rNTVGMCSFLacZ表达的小鼠GM-CSF能分泌到细胞外,具有生物学活性。结论:构建了一株能分泌表达有生物学活性的小鼠GM-CSF的重组非复制型痘苗病毒。     

表达尼帕病毒G囊膜糖蛋白重组牛痘病毒的研究

采用牛痘病毒WR株,构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV G蛋白基因的重组病毒rWR-NiV-G。Westernblot证实大小为66kDa的重组G蛋白在rWR-NiV-G感染的Hela细胞中获得表达;采用兔抗NiV高免血清间接免疫荧光检测重组痘病毒表达G蛋白显示出良好的特异免疫反应原性。rWR-NiV-G感染NiV敏感的BHK细胞系,并与NiV融合蛋白F共同表达,可形成强烈细胞融合现象。rWR-NiV-G感染免疫BALB/c小鼠,可诱导显著的NiV G蛋白特异体液免疫反应。以原核表达NiV G蛋白片段为包被抗原,间接ELISA检测rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体,具有良好的敏感性和特异性。同时,rWR-NiV-G感染免疫小鼠血清中的G蛋白特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性。结果表明,重组牛痘病毒表达的NiV G蛋白有良好的免疫原性和生物学活性功能,为进一步深入研究NiV G蛋白生物学功能、免疫原性及重组活载体疫苗研究奠定了重要基础。     

痘苗病毒通用表达载体pGJP-5的组建

我们从弱毒的痘苗病毒广-9株出发,构建了一个通用的痘苗病毒表达载体pGJP-5。广-9株的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因既作为表达载体与痘苗病毒基因组体内重组的同源顺序,又作为重组病毒的筛选标记。在TK结构基因中插入了编码痘苗病毒7.5K蛋白基因的启动基因(P_(7.5)),它可以有效地启动外源基因在痘苗病毒中表达。同时启动基因P_(7.5)的3′末端有BamHⅠ、SmaⅠ、SacⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点可供外源基因插入。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。     

痘苗病毒不同启动子对乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响

利用DNA重组和细胞体内同源重组技术,分别获得了P7.5启动子和P11启动子单独带动的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的重组痘苗病毒和同一个重组痘苗病毒中含有P7.5和P11启动子分别带动一个HBsAg基因(正反两个插入方向)的四种重组痘苗病毒,比较了它们对HBsAg表达的影响。含P7.5启动子的比含P11启动子的重组痘苗病毒表达的HBsAg水平更高些;在同一个重组痘苗病毒中P7.5和P11两个启动子分别带动HBsAg基因时,两个启动子同向转录表达的HBsAg水平较低,而两个启动子又向转录时表达的HBsAg水平较高,但均没有单一P7.5启动子带动的HBsAg基因的表达水平高。     

产生牛痘病毒外壳蛋白的重组体

东京大学医科学研究所、森永乳业、日本大学、岐阜大学、国立预防卫生研究所的共同研究小组建立了使用昆虫细胞培养物生产牛痘病毒外壳蛋白的重组株,正在探讨重组蛋白的精制法、精制的抗原可应用于凝集法的试验用抗原.这项成果在农艺化学大会上发表. 使用的病毒蛋白cDNA是医科研和东燃公司共同克隆的基因之一,大小为1.6kb.牛痘病毒具有6种外壳蛋白,建立的重组株仅能生产其中的一种.感染了病毒的牛血液中有大量抗这种蛋白的抗体,所以在野外易用的凝集法诊断时是有用的蛋白.把cDNA导入苜宿银纹     

疫苗

924368产生黄热病毒prM和E蛋白的重组牛痘病毒防治致死的黄热脑炎〔英〕/pineus,5.…了Virology一1992,157(i)一290一297〔译自DBA,1992,11(11),92一06158〕 为了在HeLa细胞培养物中表达17D黄热病毒 (YFV一17D)开读框不同部分,构建了四种重组牛痘病毒(vP766:表达C、prM、E、NSI、和NSZA,vPs6g:表达prM和E;vP729:表达E、NSI、NSZA和NSZB;vP725:表达NSI和NSZA)。表达PrM和E的vP869在小鼠中诱导高效价的中和抗体和血凝抑制抗体,保护水平与YFV一17D疫苗病毒免疫的保护水平相同。表达E和NSI、C prM、E、NSI或仅NSI的…     

利用Cre-loxP自动敲除H5亚型禽流感病毒血凝素重组鸡痘病毒中的报告基因

研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre酶自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组鸡痘病毒。免疫荧光和病毒滴度测定结果表明,经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。用10⁵PFU和2×10⁵PFU rFPV H5免疫SPF鸡,28d后,免疫组鸡抗体平均滴度(HI)分别达到4log 2和4.5log 2,结果表明,H5HA基因重组病毒能刺激鸡群产生较高特异抗体。     

牛痘病毒感染人巨噬细胞基因表达谱的RNA-Seq分析

[目的]利用RNA-Seq,分析人巨噬细胞在牛痘病毒(VACV)感染前后基因表达的变化,探索牛痘病毒与宿主细胞相互作用的机制.[方法]用牛痘病毒感染人巨噬细胞,采用RNA-Seq比较感染组和对照组的差异表达基因,并进行KEGG、GO以及STRING网络分析.[结果]感染组与对照组相比,筛选出显著性差异表达基因4796个...     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。