溶葡球菌酶的定点突变与PEG巯基定点修饰

为了建立聚乙二醇 (PEG) 巯基定点修饰溶葡球菌酶的方法,并检验假定连接区的突变与修饰对酶活的影响,对溶葡球菌酶的假定连接区进行了巯基聚乙二醇定点修饰研究。通过分析溶葡球菌酶的结构特征,选择两个结构域之间的氨基酸 (133-154aa) 进行定点突变引入半胱氨酸残基。使用单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺 (mPEG-MAL) 进行定点修饰,对修饰后的酶进行纯化并测定酶活性。结果表明定点突变的半胱氨酸残基PEG修饰效率高、产物单一,运用简便的Ni2+-NTA柱亲和层析法实现了一步分离,获得了高纯度的目标蛋白,但在连接区进行定点突变及PEG定点修饰后的酶活有不同程度的降低,表明假定连接区部分位点的PEG修饰会对溶葡球菌酶的催化活性产生一定影响。     

聚乙二醇定点修饰蛋白质药物的技术和临床研究进展

聚乙二醇(PEG)定点修饰蛋白药物是针对蛋白特定基团特定位点的修饰,相比于非定点随机修饰的特点是PEG修饰位点的单一与确定,避免了修饰异构体的干扰,能较好的保留药物体内外活性;修饰产物组成均一、性质稳定,便于质量控制,降低由修饰异构体引起的潜在的安全性风险,并很大程度上提高得率,降低成本。已有PEG定点修饰蛋白药物上市,还有部分处于临床试验阶段。本文综述了PEG定点修饰蛋白药物的技术研究与临床进展,包括PEG定点修饰剂、定点修饰方法、PEG定点修饰的上市和临床药物及面临的问题,并展望了PEG修饰技术未来的发展前景。     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ－干扰素产生菌SW－INF／DH5α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ－干扰素蛋白占菌体总蛋白的60％以上,20L发酵液可收获2kg(湿重)菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过Sephacryl S-200柱的纯化方法。简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中来采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经SDS－PAGE检测纯度达100％,核酸含量和热原均合格,A280／A260>1．5．比活性达1×10⁷IU／mg,总回收率达40％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制．为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量（5 kD和 20 kD）的单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-PAL）对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰．通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件．研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长．因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值．     

集成干扰素突变体IIFN72C的构建及其聚乙二醇定点修饰

目的：设计构建集成干扰素突变体IIFN72C并进行聚乙二醇定点修饰,以获得高活性的长效干扰素分子。方法：利用蛋白质分子同源模建,选择在集成干扰素分子IIFN的第72位引入半胱氨酸残基构成集成干扰素突变体IIFN72C。诱导表达后经包涵体变复性和层析纯化,与单甲氧基聚乙二醇（mPEGMAL）定点偶联。修饰产物经纯化后,以SDSPAGE考察其纯度,用WISHVSV系统进行生物活性测定。结果：IIFN72C以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,比活性与突变前相当;修饰产物大多数为单修饰体,纯化后纯度大于98%,比活性保留约为修饰前的8%。结论：成功设计并表达IIFN72C用于PEG定点修饰,修饰产物活性保留得以提高。     

聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

目的：用聚乙二醇（PEG）修饰集成干扰素突变体Ⅱ（IFN-Con-m2,IIFNm2）,通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。 方法：将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。 结果：干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体（mono-PEG- IIFNm2）形式存在;提纯后mono-PEG-IIFNm2 的纯度大于98%,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明：30min后,IIFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示：IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h,mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。 结论：成功地偶联了PEG和IIFNm2,建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺,PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。     

中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 P_RP_L启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×10⁷～2.34×10⁷单位/L.     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ干扰素产生菌ＳＷＩＮＦ／ＤＨ５α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ干扰素蛋白占菌体总蛋白的６０％以上,２０Ｌ发酵液可收获２ｋｇ（湿重）菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００柱的纯化方法,简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中未采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经ＳＤＳＰＡＧＥ检测纯度达１００％,核酸含量和热原均合格,Ａ２８０／Ａ２６０＞１５,比活性达１×１０７ＩＵ／ｍｇ,总回收率达４０％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(mTG)介导的单一定点修饰的PEG IFN-α2a(英文)

PEG修饰被认为是改善重组蛋白药物特性的最有效手段,包括增加蛋白质药物在体内的血浆半衰期,降低免疫原性和抗原性。目前典型的PEG修饰手段为将PEG连接至蛋白质的游离氨基,包括赖氨酸和N-末端,但这种连接缺乏选择性,产物为混合物,活性及工艺稳定性差,难以控制。酶法PEG化修饰能有效克服上述缺点,其中谷氨酰胺转氨酶(TGase)可以作为PEG化定点修饰用酶。文中选择重组人干扰素α2a(IFNα2a)进行酶法修饰反应,通过计算机模拟预测IFNα2a可以在第101位Gln特异性定点修饰。将IFNα2a与40 kDa的Y型PEG在微生物来源的谷氨酰胺转氨酶(mTG)催化下进行定点PEG化修饰。结果显示,mTG可以介导IFNα2a特异性位点Gln的单一定点PEG修饰,产生分子量为58 495.6 Da的PEG-Gln101-IFNα2a分子。圆二色谱结果显示,PEG-Gln101-IFNα2a与未修饰的IFNα2a具有相同的二级结构。SD大鼠药代结果显示,与IFNα2a相比,PEG-Gln101-IFNα2a能有效提高药代动力学参数,强于已上市PEGIFNα2a-PEGASYS?。     

γ－亚麻酸发酵条件研究

本文对γ－亚麻酸发酵的碳源、氮源、ｐＨ值、菌体得率、油脂含量、γ－亚麻酸含量等进行了考察,并通过均匀设计,得到了该菌株发酵生产γ－亚麻酸的优化配方,用优化配方发酵结果表明,菌体得率、γ－亚麻酸含量均有显著的提高。     

蛋白质的PEG化

蛋白质的ＰＥＧ化吴稷综述卢圣栋校阅（中国医科院基础医学研究所１００００５）蛋白质作为药物,已用于越来越多的疾病治疗。例如,许多由酶的缺乏或异常引起的遗传性或获得性疾病可以通过注射正常的有功能活性的酶予以缓解;许多细胞因子则被证明能用于杀伤肿瘤及调整某些免疫系统的紊乱。但是,临床观察显示,随着给药次数的增多,药效往往难以维持［１］。     

蛋白药物的聚乙二醇定点修饰策略与最佳位点

聚乙二醇修饰是一种改善蛋白质药物临床药效行之有效的方法。聚乙二醇修饰具有延长蛋白质药物在体内的半衰期、降低免疫原性和延缓蛋白酶降解、提高稳定性和溶解性等优点。而聚乙二醇的定点修饰由于能够获得均一性和高活性保留率的产物,并能提高产率,已经引起了广泛关注。综述了近年来聚乙二醇定点修饰蛋白质药物方面的研究进展,着重介绍了聚乙二醇定点修饰的策略及最佳修饰位点,并对聚乙二醇定点修饰技术的发展趋势进行了展望。     

几种金属单质及其合金修饰电极电解合成L-半胱氨酸的研究

用几种氢过电位较高的金属Ｓｎ、Ｂｉ、ＮｉＺｎ以及Ｃｕ修饰铅电极,用于电解合成Ｌ－半胱氨酸的反应,首先筛选出性能较好的Ｓｎ、Ｎｉ、Ｚｎ电极,然后对该三种金属的合金进行研究,筛选出性能优越的（Ｎｉ－Ｓｎ）／Ｐｂ电极,电极活性大为提高,反应同期转化率明显提高。     

蛋白质的类泛素化修饰

SUMO(small ubiquitin-related modifier)是一类重要的类泛素蛋白,在生物进化过程中高度保守,其三维结构及生化修饰过程与泛素类似,但该两类蛋白质修饰的生物学意义却不尽相同。SUMO化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰,广泛参与细胞活动的各个方面,且SUMO化修饰异常与许多人类重大疾病密切相关。     

微生物谷氨酰胺转氨酶催化细胞色素c赖氨酸残基的定点修饰

研究微生物谷氨酰胺转氨酶(mTG)催化细胞色素c(Cytc)的PEG定点修饰的可行性,并优化修饰条件,研究PEG修饰对Cytc性质的影响。将单甲氧基聚乙二醇氨(mPEG-NH_2)与N-苄氧羰基-谷氨酰胺-甘氨酸(CBZ-QG)共价结合制备含谷氨酰胺残基的甲氧基聚乙二醇衍生物(N-苄氧羰基-谷氨酰胺-甘氨酰-单甲氧基聚乙二醇,CBZ-QG-mPEG);mTG分别催化mPEG-NH_2、CBZQG-mPEG(mTG)修饰Cytc,研究酶法定点修饰Cytc残基的可行性;改变酶的用量、温度、反应时间和p H等反应条件优化谷胺酰胺转氨酶催化修饰Cytc的条件。研究结果表明:(1)mPEG-NH_2不能作为mTG的底物修饰Cytc,甲氧基聚乙二醇氨(mPEG-NH_2)分子上引入谷氨酰胺残基后,在mTG的催化作用下了实现Cytc的PEG修饰,而且基于mTG的底物特异性实现了PEG定点修饰Cytc的赖氨酸(Lys)残基;(2)37℃温度下,p H 8.0的溶液中,1mg/ml的mTG催化修饰反应2h是最佳修饰反应条件;(3)化学法PEG修饰Cytc产物复杂,是多种多点修饰产物的混合物,酶法催化PEG修饰Cytc只产生单一产物;(4)与天然Cytc相比,修饰后Cytc的活力、稳定性都有所提高。提出的谷胺酰胺转胺酶催化修饰法解决了蛋白质Lys残基难以定点修饰的难题,拓展了mTG在蛋白质修饰方面的应用。     

UFDS系统检测蛋白质SUMO化修饰研究

为了验证UFDS系统（Ubc9 fusion-directed sumoylation, UFDS）是否能够检测蛋白质SUMO(small ubiquitin-related modifier)化修饰,构建了Ubc9和PKCθ的融合表达载体,与SUMO1表达载体共转染293T细胞,通过免疫共沉淀和Western印迹检测Ubc9-PKCθ与SUMO1的相互作用。 结果表明,Ubc9-PKCθ与SUMO1相互作用,且SENP1共表达时导致Ubc9-PKCθ去SUMO化修饰;相较于野生型Ubc9-PKCθ,SUMO化修饰位点突变型Ubc9-PKCθ与SUMO1的相互作用显著减弱;而相较于野生型PKCθ,SUMO化修饰位点突变型PKCθ与SUMO1的相互作用则完全检测不到。 研究结果说明,应用UFDS系统能检测蛋白质的SUMO化修饰,但在鉴定潜在的SUMO化修饰位点时有一定的缺陷。