PSA启动子中RFA调节序列结合蛋白的初步研究

为了确定前列腺特异抗原(PSA)启动子中与雄激素调节相关的序列, 发现PSA启动子ARE上游一段15 bp的区域(-396～-382 bp), 是雄激素受体(AR)对PSA启动子激活所必需的, 将其命名为RFA. 转染和CAT分析显示该序列中某些核苷酸置换可显著降低雄激素对PSA基因启动子的诱导活性, 体外竞争结合实验证实某些前列腺细胞核内的非受体蛋白因子可与其特异结合, 但其突变型则丧失了这种能力, 该序列可能是一个新的辅助性顺式元件. 以RFA为探针, 利用亲和层析分离纯化了RFA结合蛋白, SDS-PAGE和蛋白质初步鉴定结果表明, 该蛋白与已知的多功能蛋白hnRNPA1, A2高度同源. RFA结合蛋白可能作为辅激活因子协同AR对PSA启动子的反式激活作用. 研究结果有助于深入理解PSA启动子的作用机制和组织特异性.     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列

应用RT-PCR和DNA克隆重组技术,从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到3个丙型肝炎病毒(HCV)5'端非编码区(5'NCR)核苷酸序列.这3个序列分别来自3个不同的丙型肝炎患者.与国内外已发表的HCV原型株同源序列比较研究发现,这3个HCV 5'NCR序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复.在YS225-1 5'NCR序列-155～-174位之间,有18个核苷酸序列缺失;在YS203-4和YS242-1 5'NCR序列-55～-56位之间,分别有28个(YS203-4)和40个(YS242-1)核苷酸序列插入.这些插入序列(28个核苷酸)在其相邻部位已有存在,即为重复序列.YS242-1插入序列中有11个核苷酸出现两次重复.其它部位的核苷酸变异也同已知基因型的相应核苷酸变异有很大差异.结果表明,这3个序列是迄今为止国内外都未曾发现过的新的HCV核苷酸序列.     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

小米psbA基因5''末端非编码区的结构特征

以小米(Setaria italica)为材料,克隆了含有叶绿体psbA基因的2.2kb EcoRⅠ片段,测定了该基因5＇末端非编码区的核苷酸序列。序列分析显示psbA基因5＇末端非编码区存在着与原核类似的启动子结构,其“-10”区的序列为TATACT,与原核生物“-10”共有基序(Consensus motif)仅相差一个核苷酸;其“-35”区的序列为TTGACA,与原核生物“-35”共有基序完全相同。另外,在“-10”区和“-35”区之间还存在着一个类似真核启动子结构的“TATATA”保守序列。这些结果表明小米psbA基因的启动子既具有原核的特征又具有真核的特征。小米psbA基因的mRNA前导序列长87bp,与高粱完全一致,而比水稻多出了“CTATTTT”7个核苷酸,比小麦、大麦和黑麦多出了“TTTT”4个核苷酸。因此推测在禾本科的C_3和C_4植物之间,psbA基因mRNA前导序列区的差异可能具有普遍性。计算机分析结果显示,以上6种植物的psbA基因mRNA前导序列区内均能形成小的茎环结构,而且这段“CTATTTT”额外序列恰好位于茎环结构中,造成了6种植物间茎环大小的差异。这一小的二级结构可能对psb…     

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.     

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。     

拟南芥生长素受体基因TIR1启动子的克隆及序列分析

以野生型拟南芥 (Arabidopsis Columbia)基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因TIR1启动子2008片段,将该片断克隆到PGM-T载体上.序列分析表明,该启动子大小为2008bp,RNA聚合酶识别序列TATA-box,TIR1特异表达和增强序列CAAT-box皆完整,与已报道的序列比较仅有3个核苷酸发生改变,同源性为99.85%.将该启动子与GUS基因融合,构建成表达载体后,在拟南芥和烟草叶片中做瞬时表达,结果分析显示:拟南芥和烟草叶片中均有GUS 酶活性存在.     

人PRL-3基因启动子的克隆及转录因子Snail结合位点的初步鉴定

促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)是重要的肿瘤转移相关基因,其转录调控机制一直未被阐明.应用TRED在线分析系统共获得3种可能的人PRL-3基因启动子区域.通过与人基因组序列进行比对,发现其中3号启动子序列距离人PRL-3基因距离最近,位于该基因上游约1 kb的DNA区域,与5′端非翻译区域邻接.在线Consite分析系统发现,-500 bp至-451bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG.运用分子克隆的方法获得PRL-3基因启动子2段区域-699 bp至299bp及-642 bp至-383 bp区域,后者具有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG.构建具有荧光素酶报告基因的pGL3载体并检测其启动子活性.-699～299 bp区域与-642～-383 bp区域的DNA片段在SW480、SW620、CNE2、293A细胞中均具有启动子活性,其中含有Snail结合位点核心寡核苷酸序列CACCTG的短片段活性强于较完整的序列.染色质免疫沉淀结合PCR扩增技术及凝胶迁移阻滞实验确定PRL-3基因启动子区域具有Snail结合位点.研究确定,PRL-3基因的启动子位于转录起始位点上游700 bp与下游300 bp的DNA区域,PRL-3基因启动子存在转录因子Snail结合元件.     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的—10区和—35区DNA序列。凝胶阻滞和启动报告基因表达的实验确证了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps),怛它的作用受其上游区域的抑制。核苷酸序列分析发现,在Ps—35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇。结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用,互补实验结果表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力。在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达。同时提出了其表达调控模型。     

利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子的克隆与序列分析

用酚氯仿抽提法提取SD大鼠的肝脏基因组DNA,PCR扩增胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）启动子并克隆至pUC118载体。从含IGFBP-1启动子的质粒中酶切分离出IGFBP-1启动子并测序。PCR扩增出420bp的目的DNA片段,与文献报道的IGFBP-1启动子DNA大小一致。经正、反两方向序列分析显示,克隆的基因序列和GenBank数据库中的IGFBP-1启动子基因序列一致。以上结果表明克隆成功了IGFBP-1启动子基因,为构建具双向调节的胰岛素分泌调控基因质粒奠定了基础。     

编码酵母丙氨酸tRNA两个半分子的DNA的克隆

用DNA合成仪合成寡聚脱氧核苷酸。用T4-DNA连接酶把这些寡聚脱氧核苷酸重组成双链DNA。这两个双链DNA的上游是T7-启动子,下游分别编码酵母丙氨酸tRNA的5′半分子(1-35位核苷酸)和3′半分子(35-76位核苷酸)。再把这两个双链DNA克隆到PUC 12质粒中。经点杂交筛选和DNA顺序测定证明克隆是成功的。     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体(FXR)基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,-1651~ 200、-1496~ 200区域的启动子活性无明显区别,-847~ 200区域的启动子活性最高,-544~ 200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在-847~-544范围内.     

用衔接头PCR克隆新的胡萝卜Ⅱ型转化酶基因启动子

 为克隆新的胡萝卜 型转化酶基因启动子 ,将胡萝卜基因组 DNA分别用 Pvu 、Eco R 、Dra 和 Sma 酶切 ,酶切片段与一特殊的衔接头连接 .取连接产物作模板 ,以衔接头引物和基因特异引物做 PCR,得到的主要 PCR产物分别为 3.4kb、1 .3kb、0 .4kb和 0 .6kb.将 Eco R -衔接头体系的 PCR产物克隆和测序 ,并将其序列与 Gen Bank中的已知序列进行比较分析 ,发现了一个新的胡萝卜 型转化酶启动子序列 ,它含有类似于 TATA box和 CAAT box的元件 ,在启动子的远上游区域还含有多个 AT富含区 .该启动子的发现对于研究植物中糖代谢具有重要意义 .     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.     

小米psbA基因5''末端非编码区的结构特征

以小米(Setaria italica)为材料,克隆了含有叶绿体psbA基因的2.2kb EcoRⅠ片段,测定了该基因5＇末端非编码区的核苷酸序列。序列分析显示psbA基因5＇末端非编码区存在着与原核类似的启动子结构,其“-10”区的序列为TATACT,与原核生物“-10”共有基序(Consensus motif)仅相差一个核苷酸;其“-35”区的序列为TTGACA,与原核生物“-35”共有基序完全相同。另外,在“-10”区和“-35”区之间还存在着一个类似真核启动子结构的“TATATA”保守序列。这些结果表明小米psbA基因的启动子既具有原核的特征又具有真核的特征。小米psbA基因的mRNA前导序列长87bp,与高粱完全一致,而比水稻多出了“CTATTTT”7个核苷酸,比小麦、大麦和黑麦多出了“TTTT”4个核苷酸。因此推测在禾本科的C_3和C_4植物之间,psbA基因mRNA前导序列区的差异可能具有普遍性。计算机分析结果显示,以上6种植物的psbA基因mRNA前导序列区内均能形成小的茎环结构,而且这段“CTATTTT”额外序列恰好位于茎环结构中,造成了6种植物间茎环大小的差异。这一小的二级结构可能对psbA基因的表达调控有一定的影响。     

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07—30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。     

超声处理导致交联DNA序列特异性断裂

目的:研究在交联状态下超声方法处理DNA是否导致DNA随机断裂。方法:通过建立一种新的Clone-Sequencing筛选技术,利用NCBI等相关网站,结合Vector-NTI等软件分析得到不同断裂位点的核苷酸序列,利用SPSS 18.0软件,对不同断裂位点核苷酸序列的分布进行统计学分析。结果:利用Clone-Sequencing技术得到216个来源于不同染色体位置的克隆片段,通过对其正义链和反义链的5’-DNA断裂末端的分析,得到432个超声断裂位点的核苷酸序列信息。对断裂位点核苷酸序列进行统计分析发现,超声处理后,交联DNA的断裂位点并不像过去认为的完全随机分布,而是存在明显的偏性,即对于所有16种不同的二核苷酸组合,超声处理导致交联DNA更易在5’-ApN-3’寡核苷酸中间的磷酸二酯键处断裂,且其相对断裂频率呈现d(ApN)>>d(GpN)>d(CpN)>d(TpN)的趋势。结论:传统的超声方法处理,交联DNA断裂位点并不是完全随机分布,而是存在着明显的序列偏好性,这一新发现提示,对于目前广泛使用的、涉及交联DNA超声处理的ChIP-Chip或ChIP-Seq等高通量及其衍生技术结果的统计分析,需要引入更加合理有效的分析策略。