Candida glycerinogenes metabolic fermentation using different carbon sources

研究了不同碳源对Candida glycerinogenes的菌体生长、发酵液pH值及代谢产物的影响,结果发现以葡萄糖、果糖等单糖为碳源时菌体生长较快,最终生物量比以蔗糖、麦芽糖等二糖为碳源时高20％～30％;导致发酵前12 h发酵液pH值明显下降的主要因素是乳酸;与葡萄糖为碳源转化为甘油相比,果糖为碳源时更易累积乙醇;以蔗糖、麦芽糖为碳源时,用于转化生成甘油的碳源明显降低,碳源主要用于菌体自身生物合成及HMP途径,以蔗糖为碳源时,用于乳酸、丙酸及柠檬酸生物合成的碳源较麦芽糖明显提高,TCA途径代谢较为活跃.     

不同碳源和生长因子条件下粒毛盘菌代谢产物初步研究

采用GC-MS法对一种粒毛盘菌(Lachnum sp.)在不同碳源、生长因子条件下发酵代谢产物的挥发性成分组成与差异进行分析。结果显示,不同碳源和生长因子条件下产生的代谢产物不同,主要包括有机酸、胺类、烷烃类、酯类、醇类、吡咯等物质。分别以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉为碳源的发酵液中检测到的挥发性代谢产物为7、7、10种;添加1 mg/L的V_C、V_(B1)、甘氨酸、色氨酸作为不同生长因子的发酵液中检测到的挥发性代谢产物分别为6、7、7、12种。结果显示粒毛盘菌YM406发酵代谢产物具有丰富的多样性,并且在不同的培养条件下产生的代谢产物存在一定的差异。     

甲烷菌对厌氧真菌不同碳源代谢的影响

【目的】探讨碳源和甲烷菌对厌氧真菌碳代谢的影响。【方法】利用体外批次厌氧发酵法,比较厌氧真菌纯培养(Orpinomyces sp.和Neocallimastix sp.)及其与甲烷菌共培养(F1:Orpinomyces sp.+Methanobrevibacter sp.和N3:Neocallimastix sp.+Methanobrevibacter sp.)发酵不同类型碳水化合物代谢产物的差异。【结果】对厌氧真菌和甲烷菌共培养F1和N3的研究显示,F1发酵木薯粉[(26.44±0.22)mmol/L]的乳酸产量是发酵玉米芯[(1.31±0.04)mmol/L]的20.18倍,是N3发酵木薯粉[(1.59±0.03)mmol/L]的16.63倍,玉米芯[(0.79±0.08)mmol/L]的33.47倍。当F1和N3中的厌氧真菌纯培养时,各组乳酸产量均1.90 mmol/L。对F1进一步研究,结果显示发酵体系中木薯粉添加量在0.8%–2.0%之间时,乳酸产量随木薯粉添加量增加而增加。当含量在1.0%–2.4%之间时,随木薯粉添加量增加,甲烷和乙酸产量逐渐降低。比较F1发酵大米粉、木薯粉、玉米粉、小麦粉和土豆粉的发酵结果,发现乳酸产量与底物中支链淀粉的含量成正相关(R2=0.9554)。当F1发酵葡萄糖和麦芽糖时,乳酸产量5.00 mmol/L。当以麦芽糊精为底物时,乳酸产量高达(28.00±0.95)mmol/L。【结论】本文首次报道碳源和甲烷菌能够增强厌氧真菌的乳酸代谢途径并且这种增强存在种属特异性。     

不同渗透压调节剂对Candida krusei生理代谢的影响

比较了氯化钠、氯化钾、甘露醇存在的高渗环境下克鲁氏假丝酵母(Candida kru-sei)的生理代谢。3种渗透压调节剂对C.krusei生理代谢影响有显著差异。与甘露醇相比,氯化钠和氯化钾对细胞生长的影响更为显著,而氯化钾对细胞的毒性则又小于氯化钠。细胞对糖的消耗速率依次为甘露醇>氯化钾>氯化钠。甘油和海藻糖是C.krusei在高渗环境下的主要相容性溶质。氯化钠和氯化钾对甘油合成的促进作用明显高于甘露醇。在0.6mol/L氯化钠、氯化钾、甘露醇存在时,细胞甘油浓度较对照提高了74%、63%、57%;胞内甘油最大含量也分别达到对照的3.1,2.4和1.8倍。高渗环境下胞内海藻糖含量在发酵前期均有所降低,但发酵后期在0.6mol/L氯化钾和甘露醇存在时海藻糖迅速积累,其含量分别达对照的1.6和1.4倍。     

假丝酵母Candida rugosa产脂肪酶条件的优化

对假丝酵母Candidarugosa产脂肪酶的条件进行了优化.比较实验证明,碳源是影响酶产量的主要因素.其中,糖类使细胞生长良好,但酶产量较低,而脂类是较为适合的碳源.本实验首次发现长链的不饱和脂肪酸酯,三油酸甘油酯是最好的碳源.氮源的影响较小.而添加物的使用是有效提高脂肪酶产量的另一种方法.PVA可促进碳源的乳化,从而提高脂肪酶产量.吐温虽没有促进细胞生长,但却大幅度提高了酶的产量.将以上优化的结果应用于发酵罐中,分批流加操作时,脂肪酶产量高达每毫升128.2单位,为目前报道的最高值.     

产朊假丝酵母利用不同有机酸作碳源的研究

分别通过不同有机酸为惟一碳源,研究了产朊假丝酵母（Candida utilis）能够利用的有机酸的种类,旨在为微生物的基础研究和应用基础研究提供部分依据。分别通过对培养时间和菌体在不同有机酸合成培养基中OD值进行统计分析,发现培养时间和柠檬酸、乳酸、琥珀酸、L-苹果酸培养基的OD值极显著相关（P〈0.01）;培养时间和乙酸、酒石酸、富马酸和草酸培养基的OD值无相关性。通过对比菌体培养前后有机酸合成培养基pH值的变化发现乙酸、酒石酸、富马酸和草酸合成培养基的pH值没有明显变化,而苹果酸、乳酸、琥珀酸和柠檬酸为碳源的合成培养基的pH值均明显增大。从而说明产朊假丝酵母能利用L-苹果酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸为碳源,而不能利用乙酸、酒石酸、草酸、富马酸为碳源。     

砷矿区农田土壤微生物群落碳源代谢多样性

采用Biolog方法研究了砷(As)矿区农田土壤微生物碳源利用多样性及其与土壤化学性质的关系.结果表明:3种土壤的N、P、K、有机质(OM)、Cu和Zn全量依次为中As＞高As＞低As土壤.中As和高As土壤微生物平均吸光度以及多样性指数(H'、D、U)显著高于低As土壤.主成分分析与生理碳代谢指纹图谱分析表明,中As和高As土壤微生物对糖类、氨基酸类等碳源的利用程度显著高于低As土壤.典范对应分析显示,影响土壤微生物群落碳源代谢的主要有全P、OM、全Pb、全Zn、全N和pH,全As并不是最主要的影响因子.可见,养分是影响长期污染土壤微生物群落结构和功能多样性的主要因素.     

砷矿区农田土壤微生物群落碳源代谢多样性

采用Biolog方法研究了砷(As)矿区农田土壤微生物碳源利用多样性及其与土壤化学性质的关系.结果表明： 3种土壤的N、P、K、有机质(OM)、Cu和Zn全量依次为中As > 高As > 低As土壤.中As和高As土壤微生物平均吸光度以及多样性指数(H′、D、U)显著高于低As土壤.主成分分析与生理碳代谢指纹图谱分析表明,中As和高As土壤微生物对糖类、氨基酸类等碳源的利用程度显著高于低As土壤.典范对应分析显示,影响土壤微生物群落碳源代谢的主要有全P、OM、全Pb、全Zn、全N和pH,全As并不是最主要的影响因子.可见,养分是影响长期污染土壤微生物群落结构和功能多样性的主要因素.     

中国东北黑土土壤剖面微生物群落碳源代谢特征

利用Biolog Eco微平板培养法,对中国科学院海伦农田生态系统国家野外科学观测研究站农田(CL)、恢复草地(GL)和人工林地(FL)土壤剖面不同深度土壤中微生物群落碳源代谢特征进行研究。理化性质结果显示,有机碳、全氮和碱解氮含量随深度增加逐渐减少,p H则是上层土壤低于底层。可培养微生物数量从表层(0—20 cm)到底层(180—200 cm)逐渐减少,在表层(0—20 cm)3种可培养微生物数量均为草地农田林地。可培养微生物主要生活在近地表0—60 cm土层中,在60—200cm土层中3种利用方式下可培养细菌、真菌和放线菌数量基本相同。Biolog结果显示,在0—40 cm土层中微生物群落活性最大,底层(180—200 cm)土壤微生物群落活性最小。3种利用方式剖面微生物群落Shannon多样性指数和碳源利用数量从表层到底层逐渐减少,并且与SOC和TN呈极显著正相关关系(P0.05)。与农田相比恢复草地和人工林地剖面20—40 cm土层中微生物群落对各类碳源的利用强度都较高,说明没有农业机械作业的植被自然生长条件下根系会打破原来农田中的犁底层,促进表层(0—20 cm)以下微生物群落活性。碳源利用率和主成分分析结果表明长期不同植被覆盖已经改变了剖面微生物群落碳源代谢特征,而且根系已经影响到100 cm的微生物群落,但还没有影响到180—200cm中的微生物群落。     

干酪乳杆菌12A碳源代谢的比较基因组学分析

【目的】在基因组学水平上,对干酪乳杆菌的碳源代谢特性及调控机制进行研究。【方法】基于BioCyc和MetaCyc数据库,利用Pathway Tools对菌株12A及7株已公布全基因序列的干酪乳杆菌进行全基因组水平的碳源代谢比较分析。【结果】全基因组比较分析结果显示,干酪乳杆菌12A可以将9种糖转运到细胞内代谢利用;可以将多种寡糖和多糖在细胞外水解成半乳糖和葡萄糖;干酪乳杆菌12A可经异型乳酸发酵或混合酸发酵途径生成乙醇及其副产物。【结论】干酪乳杆菌12A可以代谢多种类型碳源,底物选择范围宽泛,而且可以作为工业乙醇发酵的特定菌株;利用比较基因组学方法建立基因结构与细菌代谢能力的联系是可靠的。     

一些氨基酸对产甘油假丝酵母甘油生产的促进作用

以EMP途径与TCA循环中间代谢物的添加为对照,研究在尿素为氮源的产甘油假丝酵母发酵过程中添加氨基酸对甘油产量的影响。结果表明:对甘油产量有强促进作用的氨基酸有谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸和丝氨酸,其最适添加浓度在0.26～0.45g/L之间,丙酮酸、α_酮戊二酸、草酰乙酸、柠檬酸和琥珀酸的最适添加浓度在0.24～0.42g/L之间;赖氨酸最适于在0h添加,丙酮酸和草酰乙酸在第14h,谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、α_酮戊二酸和琥珀酸在第30h,天冬酰胺、丝氨酸和柠檬酸在第48h;在最适条件下添加这些促进剂,甘油产量均呈显著增加趋势,转化率和增加率分别达到60%和16%以上。氨基酸的作用机理为其脱氨形成的碳骨架经特定的分解代谢途径进入TCA循环,使其强化,导致碳代谢流在3_磷酸甘油醛节点处发生转移,使甘油合成途径的代谢流增加。     

新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。     

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)染色体倍性分析

摘要：【目的】产甘油假丝酵母作为一株优良高产甘油菌株,已成功应用于工业生产15年。近年来由于产甘油假丝酵母染色体倍性尚不明确,限制了对其进行遗传改造的研究进展,因而我们对产甘油假丝酵母染色体倍性研究,分析确定其染色体倍性。【方法】选用酿酒酵母细胞进行生孢,制备酿酒酵母单倍体细胞作对照,并选用热带假丝酵母作为二倍体酵母细胞对照,利用血球计数板得到热带假丝酵母、产甘油假丝酵母、单倍体及二倍体酿酒酵母细胞数,提取染色体,通过二苯胺检测法测定DNA含量。由于在相同紫外照射条件下单倍体细胞比二倍体细胞更容易死亡,因     

产甘油假丝酵母TRP1基因的克隆与功能分析

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) WL2002-5 是我国发酵甘油生产菌种, 具有高产甘油和耐高渗透压的优良性能。本文采用遗传互补的方法从产甘油假丝酵母基因文库中克隆了TRP1基因(CgTRP1)。序列分析显示, 该基因编码区全长735 bp, 编码的磷酸核糖氨基苯甲酸同分异构酶(CgPRAI)氨基酸序列与其他酵母来源的PRAI蛋白同源性在32.9%~49.2%之间。功能互补实验显示, CgTRP1基因在高拷贝情况下可以互补酿酒酵母trp1基因功能但在低拷贝情况下只能部分互补酿酒酵母trp1基因功能, 是一条功能明确、结构完整的酵母新基因。在CgTRP1 基因下游发现另一蛋白编码基因, 编码的氨基酸序列与酵母无机焦磷酸酶有很高的相似性。     

以Zeocin抗性基因为选择标记的Candida glycerinogenes遗传转化

为从分子水平上阐释产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)高产甘油机理,建立一种方便可行的遗传转化系统是十分必要的。与G418和潮霉素等抗生素相比,Zeocin抗生素对C.glycerinogenes具有较低的致死浓度。以pGAPZb作为构建整合载体的骨架,以Zeocin抗性基因作为选择标记,以URA3基因作为整合位点,构建了C.glycerinogenes整合载体pGA-CU。整合载体经过限制酶线性化后用作转化载体,基于电击转化的方法成功获得了抗Zeocin的转化子并经过PCR分析进一步确证。通过优化电击转化的参数,获得了较为稳定的转化效率,基于这一技术的转化效率每微克DNA可获得120个转化子。为进一步研究该菌株的遗传背景和代谢机理奠定了基础。     

玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵中的作用机理

以复合培养基和合成培养基进行比较发酵,研究了玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵过程中的作用机理。结果表明:玉米浆中的磷、氮和微量元素是影响产甘油假丝酵母甘油发酵的3个关键因素。当玉米浆磷浓度为121·75mg/L(玉米浆浓度为14g/L),最大甘油转化率达到53·44%。玉米浆磷可以调节EMP途径与HMP途径之间碳架代谢流的分布,随着玉米浆浓度进一步增加,过量磷能抑制HMP途径而激活EMP途径,因而复合培养基各项发酵参数的变化非常显著。玉米浆氮对磷的调节功能有协同作用,但并不是产甘油假丝酵母甘油发酵的理想氮源。玉米浆中的微量元素能够显著提高葡萄糖的消耗速率、促进菌体的生长和增加甘油的产量。     

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

[目的]克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性.[方法]采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp.将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp.通过电击转化酿酒酵母W303-lA.将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测.[结果]重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强.[结论]PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义.     

限磷对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了磷酸盐限量对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明, 当酵母细胞从适磷或富磷培养基转接入低磷培养基时, 发酵过程中胞内积累的磷逐渐减少; 而当菌体从低磷培养基转接入适磷或富磷培养基时, 发酵过程中胞内聚磷酸盐的积累量迅速增加。当细胞在第14小时和第38小时从适磷培养基转接入低磷培养基时甘油得率分别高达60.9%和61.4%, 而甘油产率则分别为2.03 g/(L·h)和2.23 g/(L·h)。这些现象说明限制发酵培养基中的磷浓度是产甘油假丝酵母高产甘油的必要条件, 并为其反复分批发酵法生产甘油提供了重要依据。