β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖异构酶共表达一步法催化乳糖到塔格糖

[目的]构建一株以廉价原料乳糖为底物合成塔格糖的重组菌株,实现一步法高效生物合成稀有糖——塔格糖.[方法]从Escherichia coli K-12基因组中,PCR扩增出阿拉伯糖异构酶araA和β-半乳糖苷酶lacZ基因,以SD-AS为连接子,利用pET28a-1载体串联表达于Escherichia coli BL2...     

生物转化生产D-塔格糖的食品级菌种选育及L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达

L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase,L-AI)是一种可以催化D-半乳糖为D-塔格糖的胞内异构化酶。随着塔格糖在食品工业中越来越广泛的应用,能够将半乳糖转化为塔格糖的食品级微生物以及食品级来源的L-AI受到更大的关注。文中从各种酸奶制品、泡菜及其他一些食品中采集不同的样品,筛选出1株具有L-AI酶活的食品级菌株,经过生理生化鉴定以及16S rDNA序列测定,确定该菌株为戊糖片球菌,命名为Pediococcus pentosaceus PC-5。以该菌基因组为模板,克隆L-AI基因,并在大肠杆菌BL21成功地异源表达。表达产物经粗提取后,在40℃下加入Mn2+,使D-半乳糖转化为D-塔格糖的转化率为33%。     

发酵乳杆菌来源l-阿拉伯糖异构酶理性设计及在d-塔格糖生产中的应用

L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase,L-AI)是D-半乳糖异构化生成D-塔格糖的关键酶。为提高L-阿拉伯糖异构酶对D-半乳糖的活性及在生物转化中的转化率,本研究对发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CGMCC2921来源的L-阿拉伯糖异构酶进行重组表达和生物转化应用,并对其底物结合口袋进行理性设计以提高酶对D-半乳糖亲和力和催化活性。结果显示,突变体F279I对D-半乳糖的转化率提高至野生型酶的1.4倍,进一步叠加获得的双突变体M185A/F279I的K_m和k_cat分别为530.8mmol/L与19.9s^-1,底物亲和力显著提高,催化效率提高至野生型酶的8.2倍。以400 g/L乳糖为底物时,突变酶M185A/F279I转化率高达22.8%。本研究在乳糖高值化生产塔格糖方面具有重要的应用价值。     

生物法生产D-塔格糖的研究进展

D-塔格糖具有多种独特的生理特性与功能,近年来已被发达国家开发作为具有高经济附加值的功能性甜味剂进行销售。D-塔格糖的商业化生产长期以来依赖化学催化法,随着20世纪90年代利用L-阿拉伯糖异构酶(简称L-AI酶)催化D-半乳糖制备D-塔格糖技术的兴起,生物法生产D-塔格糖成为了新的发展趋势。结合笔者所在课题组近年来的研究成果,就D-塔格糖生物法生产工艺的研究现状和前景进行综述与展望。     

微生物来源的L-阿拉伯糖异构酶的研究进展及应用前景

L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)能分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖异构为L-核酮糖和D-塔格糖,它是目前生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶.近年来,L-AI的结构已被揭晓,其基因已获得克隆、测序和过量表达,经过蛋白质工程改造的L-AI将是未来工业化生产D-塔格糖的主要用酶.本文综述了近年来国外对L-AI的结构与功能、催化机理、酶学性质及应用于D-塔格糖生产方面的研究状况,并展望了其发展前景.     

Enzymatic synthesis of D-tagatose from lactose with the combination of β-galactosidase and L-arabinose isomerase

将大肠杆菌K-12中的β-半乳糖苷酶基因lacZ和L-阿拉伯糖异构酶基因araA以串联方式克隆到载体pET-28a(+)上,并转入大肠杆菌BL21( DE3)中进行表达.通过SDS-PAGE分析发现,重组菌株能表达出大量可溶性β-半乳糖苷酶蛋白和L-阿拉伯糖异构酶蛋白.以重悬菌液为酶源,可将乳糖降解为D-半乳糖,并将D-半乳糖转化为D-塔格糖.在温度为50℃,pH 7.0的缓冲液中,经一段时间反应后,D-塔格糖的转化率可达21％以上.加入Mn2+、Co2+和Fe2+均能够使D-塔格糖的转化率提高.     

Bacillus Stearothermophilus IAM 11001 L-阿拉伯糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究球

L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。一种新型耐热L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA,来源于Bacillus stearothermophilis IAM 11001。经NCBI Blastn分析,与GenBank中Thermus sp．IM6501 araA序列的同源性为95％,并将该新基因提交到GenBank,获得登陆号：EU394214。以pET-22b（＋）为载体质粒,E．coli BL21（DE3）为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在59kDa处出现显著的特征蛋白条带;同时对重组L-AI的活性进行了初步研究,全细胞反应24小时D-塔格糖的转化率为39．8％。     

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

Bacillus Stearothermophilus IAM 11001 L-阿拉伯糖异构酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

L-阿拉伯糖异构酶是生物法生产新型功能性因子D-塔格糖最为有效的酶。本文获得了一种新型耐热L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA,来源于Bacillus stearothermophilis IAM 11001,经NCBI Blastn分析,与GenBank中Thermus sp. IM6501 araA序列的同源性为95%,并将该新基因提交到GenBank,获得登陆号：EU394214。以pET-22b(+)为载体质粒,E. coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在59 kDa处出现显著的特征蛋白条带;同时对重组L-AI的活性进行了初步研究,全细胞反应24小时D-塔格糖的转化率为39.8%。     

利用固定化重组大肠杆菌细胞生产D-塔格糖

利用经海藻酸钙包埋的重组大肠杆菌细胞催化D-半乳糖生产D-塔格糖,考察了细胞包埋量、反应条件对固定化细胞催化效率以及对D-塔格糖生产稳定性的影响。确定的最优转化条件为:温度65℃,pH 6.5,添加终浓度为1 mmol/L Mn²⁺,底物(D-半乳糖)浓度100 g/L,重组大肠杆菌细胞用量40 g/L。固定化小球在0.3%戊二醛溶液中交联30 min可以显著提高其在高温下的机械强度。考察了异构化反应体系中硼酸与底物间的摩尔比对产率的影响。研究结果表明,添加适量的硼酸可以改变原有的化学反应平衡,实现D-塔格糖的高产。利用D-半乳糖为底物在最优的反应条件下催化24 h,固定化细胞对D-半乳糖的转化率最高,可达65.8%,连续转化8批次的平均转化率为60.6%,为工业化生产D-塔格糖奠定了基础。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

β-半乳糖苷酶的研究进展

对β半乳糖苷酶的性质及作用机理作概述,同时对利用生物技术进行β半乳糖苷酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的纯化与鉴定

大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的两种纯化方法:DEAE A50和sepharose 6B两次层析法、与底物类似物的亲和层析法均可获高纯度酶,后者方法简便,适于大量制备。酶在PAGE上显示六条区带;主区带与其余三条活性带迁移率分别为13.5,7.5,6.3和4.6mm。酶主区带分子量130000。酶与其相应抗体的免疫电泳呈两条沉淀线。酶米氏常数为4.348×10~(-4)M。其SH基含量18.5个/克分子蛋白。酶悬液于4℃保存稳定性较好。活力500u/mg蛋白。可达美国Sigma Ⅵ型规格。该酶可用于抗原、抗体。如某些激素药物半抗原物质的酶免疫分析。     

阴道乳杆菌耐热β-半乳糖苷酶的鉴定

利用改良的MRS培养基,从鸡粪样本中分离到多株产β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株。酶学性质分析发现,菌株1-1产生的β-半乳糖苷酶在37℃~60℃相对稳定,37℃酶活力达到183.9NLU/g菌体干重。进一步分析16S rRNA基因序列,确定菌株1-1为阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)。扩增分析β-半乳糖苷酶编码基因lacL和lacM,结果发现LacL亚基有642个氨基酸,LacM亚基有321个氨基酸,与罗伊氏乳杆菌MM2-3相应蛋白的相似性分别为86%和84%。     

耐热重组β-半乳糖苷酶的制备及酶稳定性研究

编码嗜热脂肪芽孢杆菌β—半乳糖苷酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600／pMA5—bgαB,经5L发酵罐发酵收集菌体超声波破壁,冷冻离心后再经过热处理和盐析纯化,比活力达80．3U／mgpr,回收率73．6％,纯化倍数12．4倍。β—半乳糖苷酶在细胞内及破壁后都具有较好的稳定性,60℃热处理对酶构象的影响不大。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。     

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。     

节杆菌β-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

分离纯化了由节杆菌所产的fI-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)并研究了其酶学性质.以乳糖发酵培养基培养,离心收集茵体,超声破碎细胞得到粗酶液;采用硫酸铵沉淀、Phenyl-Sepharose疏水、DEAE-Sepharose离子交换和p-aminobelazyl-1-thio-β-galactopyranoside...