用富集文库克隆人胰岛素基因组基因

通过构建可富集人胰岛素基因的λ噬菌体文库,克隆了人胰岛素基因组基因．首先从中国人血液白细胞中提取到人基因组ＤＮＡ,用ＥｃｏＲⅠ和ＢｇｌⅡ对基因组ＤＮＡ进行全酶切,经０．４％琼脂糖凝胶电泳,特异回收９．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段．将该片段与λＥＭＢＬ３／ＢａｍＨⅠ臂连接,构建成一个特殊的人基因组λ噬菌体文库（富集文库）,效价为２×１０４．同时采用ＰＣＲ方法及用引物Ⅰ：５′ＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧ３′,引物Ⅱ：５′ＣＴＧＣＧＴＣＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣ３′,从人基因组ＤＮＡ中扩增出一段含胰岛素基因的１．３６ｋｂＤＮＡ片段,做为放射性标记探针,对文库进行了噬菌斑原位杂交筛选,从１×１０４个噬菌斑中筛选到一个含人胰岛素基因组基因的阳性克隆,并进一步完成了亚克隆和该基因１７３２ｂｐＤＮＡ序列的测定．结果该基因的１７３２ｂｐＤＮＡ序列包括部分５′端和３′端与国外发表的人胰岛素α型等位基因的序列相同     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

家蚕滞育激素基因的克隆

利用放射性同位素３２Ｐ－ｄＣＴＰ标记家蚕滞育激素ｃＤＮＡ作为探针,从家蚕基因库大约４×１０~５个噬菌体斑中筛选得到３０个阳性克隆,其中３个克隆具有相同的限制性内切酶图谱,并测知插入ＤＮＡ约１８ｋｂ,用限制性内切酶ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ切割,进行次克隆。用ＴａｑＤｙｅｐｒｉｍｅｒ序列测定法,得到部分核苷酸序列,经比较,鉴定了这３个克隆确属滞育激素基因。基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析,推定家蚕滞育激素基因属单基因编码。     

黑曲霉3.795glaA基因及其5'调控区的克隆和序列分析

黑曲霉Ｔ２１是由黑曲霉３．７９５经诱变育种获得的糖化酶高产菌株,为阐明其高产的分子机制,由黑曲霉３．７９５克隆了糖化酶结构基因及其５′旁侧序列,并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较．由黑曲霉３．７９５菌丝体分离染色体ＤＮＡ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,糖化酶结构基因位于～２．５ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＥｃｏＲⅤ染色体ＤＮＡ片段上,在此ＥｃｏＲⅠ位点上游约１．０ｋｂ处有一ＳａｌⅠ位点．为构建糖化酶结构基因及其５′旁侧序列的基因组文库,该染色体ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲⅠ＋ＥｃｏＲⅤ和ＥｃｏＲ＋ＳａｌⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分离并回收长度在１．０ｋｂ左右和２．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段,分别与ｐＵＣ１９载体连接后转化入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５．用原位杂交方法筛选到了携带糖化酶基因编码区及其１５０５ｂｐ５′旁侧序列的阳性克隆．对克隆片段的ＤＮＡ序列进行了测定并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较,结果表明,在糖化酶基因编码区及其１５０ｂｐ３′非编码区内,未发现碱基差异,但在－３４０～－１５０５的５′上游区内发生了９个位置的碱基变化,包括缺失、插入和替换．这些结果表明,黑曲霉Ｔ２１与３．７９５的糖化酶产量的差异与其结构基因无关,但可能与其     

变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株,编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上,中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在,其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性,其氨基酸序列的同一性高达３７％,相似性达５８％,而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的,该区域与λ的复制无关。此外,这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％,低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。     

Yunnanese(~Aγδβ)~0-地贫缺失桥片段的克隆及缺失连接区的序列测定

为研究导致Ｙｕｎｎａｎｅｓｅ（Ａγδβ）０－地贫缺失事件的分子机制,并从３′并入序列中搜寻增强子类序列,使用ＥＭＢＬ３为载体构建了一例缺失杂合子的基因组文库,筛选到来源于异常染色体１１并包含Ｇγ珠蛋白基因区６．７ｋｂ序列以及１１．５ｋｂ３′并入序列（即缺失桥片段）的克隆．此１１．５ｋｂ序列在正常染色体中位于β珠蛋白基因约下游６６～７８ｋｂ区域．详细分析了这一区域的限制性内切酶图谱．分析了围绕缺失连接区的ＤＮＡ序列,精确定位缺失的５′端点发生在Ａγ珠蛋白基因上游－１１６～－１１７碱基之间．确定缺失的３′端点处于一个Ｌ１序列内,位于β珠蛋白基因下游～６６ｋｂ,距离Ｃｈｉｎｅｓｅ（Ａγδβ）０－地贫缺失３′端点上游～１２．２ｋｂ的一个ＥｃｏＲⅠ位点上游４１３ｂｐ．围绕５′和３′端点的序列之间无明显同源性,说明这一缺失代表了体内的非同源重组事件．这一重组事件可能由Ｌ１序列介导．缺失３′端点下游序列的克隆分离也为进一步从中搜寻加强子类序列奠定了基础     

麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

酵母PH081基因的克隆和表达

从酵母染色体ＤＮＡ中获得１个约３．０ｋｂ的ＢａｍＨＩ的克隆片段和１个约５．０ｋｂ的ＰｓｔＩ片段,前者包含１７４５ｂｐ的ＰＨＯ８１基因编码序列及１２４４ｂｐ的上游列,后者包含２２３６ｂｐ的编码序列及约２．８ｋｂ的下游序列,经拼接得完整的ＰＨＯ８１基因。以ＵＲＡ３基因取代部分ＰＨＯ８１的编码序列,通过体内同源重组,获得ＰＨＯ８１基因缺陷的酵母细胞株。构建ＰＨＯ８１－ＬａｃＺ融合基因,以β－半乳糖苷敏的     

BstNI同功酶限制—修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍ）基因表达的检测。用外切酶Ⅲ单向删切含Ｒ－Ｍ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ和０．２→１．４ｋｂ和１．５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ⅱ类限制－修饰系统,两     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源 .根据 3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物 ,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为 76 8bp的mdYP1基因的部分DNA片段 .经地高辛标记成特异性探针 ,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆 ,并从该克隆中分离到大小为 3991bp的mdYP1基因组基因 .序列分析显示 ,该基因组序列含有约1 6kb的 5′ 上游区和 1 0kb的 3′ 下游区 ,编码区由一个 6 1bp的内含子和大小分别为 2 2 2bp和10 2 8bp的 2个外显子组成 .5′ 上游区含有典型的CAAT TATA盒 .     

连续3步缺口修复构建人β肌动蛋白-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的:为了获得稳定高效表达凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞株,构建一个利用人β肌动蛋白(hACTB)基因座完整的上下游调控序列指导人凝血因子Ⅶ(hFⅦ)基因组序列在人胚胎肾细胞特异性高效表达的hACTB-hFⅦ杂合基因座。方法:采用3步连续缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂,构成能进行3次连续基因抓捕的载体。然后在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术:第一步,从含hACTB基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆10 kb的hACTB基因3′端完整侧翼序列;第二步,从hFⅦBAC上亚克隆13 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAG)的hFⅦ基因组序列;第三步,从hACTB BAC上亚克隆20kb的hACTB基因5′端完整侧翼序列,并使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成全长约50 kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座达到了原来hACTB基因座中hACTB基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ从起始密码子到终止密码子的基因组序列基因组序列精确置换的目的。结论:连续3步缺口修复构建杂合基因座细胞表达载体的技术,将为细胞高效表达大载体的制备提供一种全新的思路和方法。     

大鼠肝含5~1端氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因的克隆

为研究氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPS Ⅰ)基因表达的调控,我们根据CPS Ⅰ编码1—10氨基酸的mR NA顺序,合成一个30碱基的寡聚核苷酸。以它作为探针从大鼠肝基因库中筛选出一个阳性克隆,λ10。对其中4.5kb插入片断的内切酶谱及部分核苷酸序列测定证明它确含5′上游CPS Ⅰ基因DNA序列。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与功能分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因5′上游序列序列,并对其功能进行分析。方法: 利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI、Xbal 6种限制性内切酶分别酶切盐藻基因组DNA,并与接头连接,构建成盐藻基因组步行文库。采用 LA-PCR方法,从上述盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5′上游序列序列,测序并进行分析。为检测其表达特性,构建了该片段与GUS 嵌合基因的表达载体pNR-GUS, 通过电击法将所构建的重组表达载体转化盐藻,组织化学染色法观察GUS的表达。结果: 从盐藻基因组步行文库中扩增出约1200bp特异片段,序列分析表明5′上游序列含有启动子的特征性序列。GUS瞬时表达染色结果显示,该DNA 片段具有硝酸盐诱导和铵抑制的启动子活性。结论：所克隆的盐藻的5′上游序列可能是一种具有"开关"活性的可控性启动子。     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域