DNA条形码在鳞翅目昆虫中的应用

2003年,Hebert等提出DNA条形码后,快速而精确的特点使它在物种鉴定中得到了广泛的应用。鳞翅目是昆虫纲中第二大目,其物种鉴定任务复杂而艰巨,因此DNA条形码具有广阔的应用前景。该文主要针对DNA条形码概况以及近年来它在鳞翅目昆虫中的研究情况予以综述。     

DNA条形码技术在北京百花山地区夜蛾科物种鉴定中的应用

为了探讨DNA条形码技术在夜蛾物种鉴定中的可行性, 本研究利用条形码通用引物扩增了北京百花山地区43种夜蛾75个样本的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I （mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I, COI）基因序列, 以Kimura双参数模型进行种内种间遗传距离分析、 使用邻接法（neighbor-joining, NJ）和最大简约法（maximum parsimony, MP）分别构建系统发育树, 并利用分子序列差异阈值对样本进行分子可操作分类单元（molecular defined operational taxonomic units, MOTU）划分。结果表明： 所有夜蛾种类通过系统发育树可以成功区分; 种内平均遗传距离(0.03%)远远小于种间平均遗传距离(11.29%); 采用较为保守的1%的序列差异阈值将75个夜蛾样本分为42个MOTU, 正确率为95%, 除了MOTU04包含2个物种外, 剩余41个MOTU与形态种呈现一一对应的关系。结果显示, 基于COI基因的DNA条形码对于本研究中所涉及的夜蛾具有较好的区分, 可以作为一种有效的工具在夜蛾科昆虫物种鉴定中进行应用。     

基于进化树、距离和特征的DNA条形码方法研究——以百花山地区草螟科为例

DNA条形码是一种快捷高效的分子鉴定新技术,近年来在动物分类学领域中得到迅速的发展和应用。在条形码的研究中有基于进化树、距离和特征3种常用的分析方法:第1种方法需要构建系统发育树,分析样本在树上的聚类情况;第2种方法依赖于物种种内和种间的序列差异;第3种则是通过一系列的诊断特征位点来鉴定物种。本研究扩增了北京百花山地区14种草螟科昆虫88个样本的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ,COⅠ)基因片段,分别基于进化树、距离和特征方法进行了分析,以探讨不同DNA条形码方法在草螟科物种鉴定中的可行性。结果表明:在使用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建的系统发育树上,14个草螟物种各自聚成一个单系,均被成功区分。基于Kimura双参数模型计算遗传距离得出,种内和种内有一个明显的"barcoding gap",且ABGD软件对样本的划分完全符合形态鉴定结果。在所有的草螟物种中都找到了诊断核苷酸位点,基于特征来鉴定草螟物种的成功率为100%。结果显示,这3种方法对于本研究中所涉及的草螟都具有较好的区分,基于COⅠ基因的DNA条形码可以作为一种有效的工具在草螟科昆虫的物种鉴定中进行应用。     

三峡库区常见鱼类DNA条形码本地BLAST数据库的构建和应用

本研究采集三峡水库库区6目10科41属51种常见鱼类样本,测定了DNA条形码COI基因652 bp同源片段,初步分析条形码序列特征、不同分类水平下K2P遗传距离及系统发育关系.研究发现:属内种间平均遗传距离为0.061,科内属间平均遗传距离为0.110,目内科间平均遗传距离为0.206.DNA条形码具有较高的物种鉴别率...     

检疫性昆虫DNA条形码检测技术的研发与应用实例

【目的】DNA条形码技术是近年来生物分类鉴定的研究热点之一,已成为植物检疫性昆虫鉴定的有力工具。为快速、准确地鉴定口岸截获的昆虫种类,实现"检得出、检得准、检得快"的要求,我们研发了昆虫DNA条形码试剂盒检测技术(Insect DNA barcoding identification kit)。【方法】该检测技术针对出入境植物检疫性及危险性昆虫的主要类群,选择合适的基因片段、设计引物、对目标基因进行扩增测序,找出基因片段上区分每个物种的多态位点规律,作为该物种的鉴定特征并建立数据库,应用于植物检疫性及危险性昆虫的物种鉴定。【结果】以检疫性昆虫木蠹象属Pissodes为例,确定了木蠹象属5种昆虫的多态位点规律(鉴定特征),构建了用于物种鉴定的数据库。通过比对数据库里的鉴定特征,将未知样品鉴定为榛梢木蠹象P.terminalis(相似度100%),与形态鉴定结果一致。本文介绍了检测技术的原理、方法、技术流程及应用实例,并展望了其在有害生物检测中的推广应用前景。【结论】昆虫DNA条形码试剂盒检测技术为建立标准化,准确性高的物种鉴定平台打下基础,有着良好的推广应用前景。     

基于DNA条形码技术构建王朗国家级自然保护区陆生脊椎动物遗传资源数据库及物种鉴定

DNA条形码(DNA barcode)是基因组中较短的、种内变异相对稳定的基因序列,已经成为生物多样性保护研究中物种鉴定、生物多样性评估的有力手段之一。四川王朗国家级自然保护区地处青藏高原东缘,属于世界生物多样性热点地区,具有丰富的生物资源,在我国珍稀动物保护领域具有重要地位。目前保护区已累积了大量的陆生脊椎动物监测数据,但缺乏遗传资源本底调查和基础的遗传资源数据库。本研究基于DNA条形码技术,以四川王朗国家级自然保护区为主要研究区域,基于样线法和博物馆标本调研,对所采集的314份样品进行DNA条形码分析,共鉴定兽类、鸟类、两栖类18目35科74种,首次获得了王朗齿突蟾(Scutigerwanglangensis)的线粒体基因(COI、12S-16S、16S、Cytb)及核基因(RAG1)的条形码序列信息,并通过比较不同监测方法说明了DNA条形码技术在动物多样性调查中的应用前景。本研究基于DNA条形码技术最终获得了216份DNA条形码数据,初步建立了保护区陆生脊椎动物遗传资源数据库,该数据库将为评估保护区生物多样性提供基础信息,为动物保护和管理工作提供技术支持。     

DNA条形码技术在青海海东地区小型兽类鉴定中的应用

为弥补传统形态分类方法的不足,探究应用DNA条形码技术进行分子生物学鉴定的可行性,本研究用DNA条形码技术检测了青海省海东地区3目6科14属18种110只小型兽类的COI基因部分序列。分析所测COI基因序列可知:种内遗传距离≤3%,种间遗传距离5-10%,属间遗传距离12-19%,种间遗传距离显著大于种内遗传距离。NJ树显示同种个体聚为有很高支持度的单一分支。有6个个体(4只黄胸鼠、2只小家鼠)在现场鉴定中被误定为其他种类。研究结果表明使用条形码技术能纠正形态学鉴定中的错误,也说明动物线粒体COI基因是一个有效的DNA条形码标准基因。     

基于DNA条形码的物种丰富度估计: 以宿迁地区鳞翅目蛾类为例

为了探究基于DNA条形码方法量化物种多样性指标的可行性, 本研究以江苏省宿迁地区蛾类群落为例, 基于DNA条形码方法估计群落物种丰富度并绘制等级多度分布曲线(rank-abundance curves), 同时与基于传统形态学的对应指标进行比较。结果表明: (1)基于DNA条形码的物种丰富度估计与基于形态的物种丰富度估计之间没有显著差异; (2)基于形态和DNA条形码的等级多度分布曲线趋势一致, 通过K-S检测发现二者之间没有显著性差异(P > 0.05)。结果显示, 基于DNA条形码的物种丰富度估计能够在一定程度上补充基于形态学的方法, 可以尝试将其应用于蛾类群落生态学调查研究中。     

DNA条形码技术在田间常见蓟马种类识别中的应用

蓟马类害虫种类多、 体型小, 传统的形态学鉴定方法难以快速准确识别。本研究利用DNA条形码通用型引物, 以我国田间常见的25种蓟马为靶标扩增其线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ gene, mtDNA COⅠ) 基因 (约650 bp), 通过对靶标片段碱基序列的测序及比对分析, 以邻接法 (NJ法) 构建系统发育树, 并以Kimura双参数模型计算种内、 种间遗传距离。结果表明： 聚类分析与形态学鉴定结果一致, 表现为较长的种间分支和较短的种内分支, 每个单系分支对应一个物种, 同一物种不同单倍型的最初分支自展值均为100%。25种蓟马的种内平均遗传距离为0.0027, 种间平均遗传距离为0.2757, 种间遗传距离为种内遗传距离的102.1倍; 而且种内、 种间遗传距离没有重叠区域。结果说明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于不同种类蓟马的快速准确鉴别。     

基于线粒体COⅠ基因的齿小蠹属昆虫DNA条形码研究

齿小蠹属（鞘翅目： 小蠹科）昆虫是植物检疫中经常截获的类群, 为探讨线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特定区段作为DNA条形码快速准确鉴定齿小蠹种类的可行性, 以齿小蠹属昆虫为研究对象, 测定分析了线粒体COⅠ基因462 bp碱基序列。序列分析结果显示： 变异位点为259个, 保守位点203个, 简约信息位点181个, 自裔位点78个。所有位点中, A, G, C和T碱基平均含量分别为30.7%, 16.5%, 17.0%和35.8%。A+T含量较高, 为66.5%, 明显高于G+C含量, 表现明显的A+T碱基偏嗜, 且A与T含量相当, 符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。转换与颠换结果显示： 该段序列未达到饱和, 可以得到准确的进化分析。利用Kimura 2-parameter模型分析遗传距离得到, 同物种间的遗传距离介于0.002~0.007之间, 不同种间的遗传距离介于0.056~0.431间, 平均遗传距离为0.199, 说明该段序列能够区分不同物种。基于COⅠ基因序列构建的邻接法系统发育树（NJ树）显示, 同一物种聚为同一小支, 且分支自展值均为100%; 近缘种能聚集在一起, 且置信度很高（≥97%）。结果表明应用基于COⅠ基因片段的DNA条形码进行齿小蠹属昆虫分类鉴定具有可行性。     

以雾灵山夜蛾科为材料评估进化模型对DNA条码分类的影响

为了探究进化模型对DNA条形码分类的影响, 本研究以雾灵山夜蛾科44个种的标本为材料, 获得COI基因序列。使用邻接法（neighbor-joining）、 最大简约法（maximum parsimony）、 最大似然法（maximum likelihood）以及贝叶斯法（Bayesian inference）构建系统发育树, 并且对邻接法的12种模型、 最大似然法的7种模型、 贝叶斯法的2种模型进行模型成功率的评估。结果表明, 邻接法的12种模型成功率相差不大, 较稳定; 最大似然法及贝叶斯法的不同模型成功率存在明显差异, 不稳定; 最大简约法不基于模型, 成功率比较稳定。邻接法及最大似然法共有6种相同的模型, 这6种模型在不同的方法中成功率存在差异。此外, 分子数据中存在单个物种仅有一条序列的情况, 显著降低了模型成功率, 表明在DNA条形码研究中, 每个物种需要有多个样本。     

基于系统发育分析的DNA条形码技术在澄清芍药属牡丹组物种问题中的应用

清晰的物种概念是材料正确鉴定的基础,是DNA条形码技术应用的前提.本文通过芍药属牡丹组植物DNA条形码数据的系统发育分析,揭示牡丹组植物的进化谱系及其与分类上“物种”的关系.在此基础上分析DNA条形码技术在牡丹组植物中应用的可能性.同时,以芍药科芍药属牡丹组植物为例,讨论DNA条形码技术在应用中存在的问题与解决方案.研究材料包括牡丹组植物目前已知的几乎所有的变异类型（种或种下分类群）共40份.DNA序列来自叶绿体基因组ndhF,rps16-trnQ,trnL-F和trnS-G4个基因,共有（含插入/缺失）5040个位点,包含96个变异位点,其中信息位点69个;核基因组GPAT基因2093~2197bp,变异位点（含插入/缺失）总数279个,其中信息位点148个.叶绿体基因组与核基因组所揭示的包括四川牡丹、矮牡丹、卵叶牡丹和紫斑牡丹在内的进化线与根据形态所建立的物种限定不吻合：（ⅰ）叶绿体基因分化明显但核基因没有明显分化——四川牡丹和紫斑牡丹的各居群系统;（ⅱ）核基因分化显著而叶绿体基因分化很小——矮牡丹和卵叶牡丹.因为这些居群系统之间存在一定程度的地理隔离,但不存在生殖隔离,出现这种两个基因组数据背离的现象可能是由于不同居群系统在进化历史中捕获了其他居群系统的叶绿体基因组.这些基因作为牡丹组植物DNA条形码的适合性分析显示,叶绿体基因在种间或居群系统之间的变异是种或居群系统内变异的4.82倍,GPAT基因在种间或居群系统之间的变异是种或居群系统内变异的2.21倍,说明这些基因可作为牡丹组植物的DNA条形码.种间或居群系统之间完全分化位点的统计结果表明,这些种或居群系统之间存在相互区别所必需的位点.通过牡丹组植物DNA条形码分析,认为：（ⅰ）物种概念对DNA条形码技术能否成功应用有十分重要的影响,拟应用DNA条形码的类?     

植物DNA条形码技术的发展及应用

在对DNA条形码技术的发展过程进行归纳分析的基础上,对植物DNA条形码技术的研究进展、工作流程及分析方法、影响其鉴定准确性的因素及其在植物分类学研究中的应用现状及存在的争议进行了综合分析和阐述,并展望了植物DNA条形码技术的发展趋势及应用前景。通过具体实例说明将植物DNA条形码技术与传统植物学知识相结合可作为民族植物学的研究手段之一。认为:目前常用的植物DNA条形码主要有单一片段和多片段组合2种方式,这2种方式各有优缺点;常用的DNA序列有matK、trnH-psbA、rbcL和ITS等,但均有一定的局限性;针对不同的使用目的,应选择不同的植物DNA条形码标准;影响植物DNA条形码鉴定准确性的因素包括物种的类型和数量、系统树构建方法、杂交/基因渗入、物种起源时间的差异、分子进化速率差异等;当前植物DNA条形码研究工作的重点是选择合适的DNA片段并对其进行评价。     

DNA条形码试剂盒检测技术在大小蠹属种类鉴定中的应用

[目的]DNA条形码技术已成为生物分类鉴定的有力工具.DNA条形码技术的相关问题,如物种种内和种间的遗传距离出现重叠区域,将直接影响到物种鉴定的准确性.我们应用DNA条形码试剂盒检测技术来快速、准确地鉴定口岸截获的检疫性大小蠹属种类.[方法]针对大小蠹昆虫设计引物以提高PCR扩增效率.运用自主研发的基因条码分析软件找出基因片段上区分每个物种的多态位点规律,作为该物种的鉴定特征并建立数据库,应用于物种鉴定.[结果]使用针对大小蠹属昆虫设计的引物成功扩增出325 bp的COI基因片段.将大小蠹属12种昆虫的COI基因片段上的核苷酸诊断位点的组合作为物种的鉴定特征,可以准确地区分近似种.通过比对植物检疫鉴定系统数据库里的鉴定特征,将6个大小蠹属的未知样品成功鉴定到种(核苷酸序列一致性为100％),与形态鉴定结果一致.[结论]结果表明DNA条形码试剂盒检测技术可以准确鉴定大小蠹属的种类.该检测技术可以应用于其他经济重要性有害生物的检测鉴定.     

鳞翅目成虫乙醇保存标本基因组DNA的提取及在微卫星研究中的应用

高质量的基因组DNA样品是分子生态学研究的先决条件。本研究目的在于探索从东方粘虫Pseudaletia separata (Walker)成虫自然种群的乙醇保存标本中分离高质量基因组DNA的有效方案。在2 mL微型离心管中进行4种提取方案的实验比较,结果发现采用传统的苯酚抽提方法的2种方案提取腹部中段组织的基因组DNA,样品合格率只有7.69%~40%。但是,如果在苯酚抽提以前加入高浓度盐和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）,就会使DNA样品合格率达到68.42%~95.28%,而且DNA平均产量达到5.59~10.04 mg/g,明显高于前者的2.83~5.78 mg/g （统计检验表明,在不同种群中差异显著或不显著）。研究结果还证明腹部组织比胸部组织更适宜提取DNA。对来自一个自然种群的99头东方粘虫DNA合格样品的统计分析表明,DNA提取总量（μg）与组织样品用量（mg）之间存在弱的正相关关系,平均DNA提取量（mg/g）与组织样品用量（mg）之间存在中度负相关关系。总之,在2 mL微型离心管中,用10~20 mg腹部组织,利用CTAB+苯酚抽提方法可以获得高纯度和高含量的基因组DNA样品。用该方案提取的基因组DNA能够顺利地进行微卫星位点的分离和基因分型。     

高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用

转录组是指组织或者细胞在某一特定状态下转录出来的所有RNA的集合。高通量第2代测序技术使转录组学的研究模式发生了巨大的改变,所衍生出的转录组测序迅速成为研究非模式生物的先进技术。转录组测序能够在整体水平上探究细胞内基因表达的种类和数量,揭示在特定条件下机体生理生化发生过程以及其中的分子机理。本文简要阐述了转录组测序技术的基本概念、技术流程与原理,详细介绍了转录组测序在解决鳞翅目昆虫的分类、毒理、发育、与寄主互作以及非编码RNA调控等问题上做出的贡献,并对该技术现存的困难进行了系统的阐述并对其未来的发展趋势作出了简要的预测与剖析。     

基于线粒体COⅠ的DNA 条形码技术在贻贝科种类鉴定中的应用

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桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。