银杏叶提取物和槲皮素对心肌细胞肥大的防治作用及其机制

目的：探讨银杏叶提取物（EGb）及其单体槲皮素（Que）对心肌细胞肥大的防治作用及其机制。方法：采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导新生大鼠心肌细胞肥大模型;分别在培养液中加入EGb（40／μg／ml）或Que（4／μg／m1）,观察Lowry法测定心肌细胞蛋白质含量的变化;测定SOD活性和MDA含量观察心肌细胞氧自由基代谢的变化;Western blot方法检测心肌细胞p-ERK1／2、p-JNK和p-P38蛋白表达;应用RT-PCR法检测心肌细胞c-fos mRNA表达。结果：①EGb和Que能明显抑制AngⅡ引起的心肌细胞总蛋白质含量的增加;②EGb和Que可显著提高SOD活性,降低MDA含量;③AngⅡ诱导的心肌细胞p-ERK1／2、p-JNK和p-P38表达均明显增强,Que能明显抑制AngⅡ诱导的p-JNK表达;④EGb、Que、可降低AngⅡ诱导心肌细胞c-fos mRNA表达的上调水平。结论：EGb和Que对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大有明显的防治作用,Que的作用机制可能与ROS／JNK／c-fos信号通路有关。氧化应激参与了心肌肥大的发生发展过程。     

一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制

本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞,从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮（NO）信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽（ANP）的表达作为心肌肥大反应的指标,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平,以免疫印迹法测定MKP－1蛋白表达,以RT－PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现：（1）L－精氨酸（L－Arg)10,100μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16％及31％,L－Arg(100μmol/L）还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达,其作用可被NOS抑制剂L－NAME所抑制;（2）L－Arg(100μmol/L）可降低AngⅡ(0.1μmol/L）诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率,而在L－Arg处理之前用针对MKP－1的反义寡核苷酸转染心肌细胞,蛋白合成速率明显增加,可取消L－Arg的抑制作用,甚至超过AngⅡ组;（3）L－Arg(100μmol/L）明显增加MKP－1蛋白表达,比对照组增加225％,NOS抑制剂L－NAME及蛋白激酶G（PKG）抑制剂KT－5823皆可抑制L－Arg诱导的MKP－1蛋白表达,分别抑制88％、83％,而AngⅡ能增加L－Arg诱导的MKP－1的表达,较对照组增加365％,增强了L－Arg的作用。以上结果表明,NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG,促进MKP－1的表达,从而增加MAPK去磷酸化实现的。     

非诺贝特通过FoxO1 抑制心肌肥大

目的:探讨非诺贝特(fenofibrate)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的抑制作用及对FoxO1表达的影响。方法:首先采用AngⅡ诱导心肌细胞肥大,将细胞分为三组:对照组:未给予任何干预;心肌细胞肥大组:AngⅡ(10-7mol/L)刺激细胞;治疗组:先给予fenofibrate(10-5mol/L),30min后AngⅡ(10-7mol/L)刺激细胞。应用蛋白免疫印迹法(western-blotting)和实时定量PCR法(real time PCR)检测各组细胞中转录因子FoxO1的蛋白质及mRNA含量,心肌细胞肥大的判断使用脑钠肽(brain natriuret icpepide BNP)。结果:心肌细胞肥大组的FoxO1表达较对照组明显降低,而治疗组的FoxO1表达较心肌肥大组明显升高。结论:非诺贝特可能通过上调FoxO1表达,从而抑制心肌细胞肥大。     

一氧化氮抑制血管紧张素Ⅱ和内皮素-1诱导的心肌细胞原癌基因c-fos表达

在原代培养的新生大鼠心肌细胞上, 探讨一氧化氮 (NO)对血管紧张素Ⅱ (AⅡ)和内皮素-1 (ET-1)诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达的影响.用Bradford 法测定心肌细胞总蛋白含量 (作为心肌细胞肥大的指标); 用基因特异性引物和 SuperScript一步法进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR), 检测大鼠心肌细胞原癌基因c-fos的表达 (以GAPDH为内标).结果显示, AⅡ和ET-1分别作用5 d和3 d后, 心肌细胞总蛋白含量显著增加; 硝普钠 (NO供体)可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞总蛋白增加.AⅡ,ET-1和PMA (蛋白激酶C激动剂)均可诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达; L-精氨酸可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达, L-NAME (NOS抑制剂)可抑制L-精氨酸的这一作用; 硝普钠对可抑制AⅡ,ET-1和PMA诱导心肌细胞原癌基因c-fos的表达.结果表明, NO可抑制AⅡ或ET-1诱导的心肌细胞肥大和原癌基因c-fos表达, 其作用机制可能与蛋白激酶C这一环节有关.     

L-型钙电流在血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大中的作用

目的:探讨血管紧张素II(Ang II)诱导的新生大鼠肥大心肌细胞中L-型钙电流的功能在分子水平改变。方法:在血管紧张素II诱导的新生大鼠肥大心肌细胞中,应用全细胞膜片钳技术检测L-型钙电流的密度及门控动力学变化;应用半定量RT-PCR技术检测L-型Ca2+通道α1C亚单位mRNA的表达量。结果:Ang II在引起新生大鼠心肌肥大的同时,也增加了心肌细胞ICa,L电流密度,但并不影响ICa,L电流的激活、失活和复活特征。另外,Ang II还增加了L-型Ca2+通道α1C亚单位mRNA表达量。Ang II的这些作用都可被其1型受体阻断剂losartan所抑制。结论:在Ang II诱导的新生大鼠肥大心肌中,L-型Ca2+通道的功能在分子水平发生了显著变化,这些变化是通过激活心肌细胞上Ang II 1型受体所介导的。     

凋亡诱导因子介导缺氧/复氧致肥大心肌细胞凋亡的作用

心肌细胞凋亡导致心肌组织合胞体功能丧失,最终使代偿性心肌肥大向心力衰竭转化。过去的研究已经确认天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspartate-specificcysteinylproteinase,caspase)依赖机制在心肌细胞凋亡中的作用,但对caspase非依赖机制即凋亡诱导因子(apoptosis-inducingfactor,AIF)在心肌细胞凋亡中的作用尚不明确。本研究应用血管紧张素Ⅱ(0.1μmol/L培养12h)诱导培养的小鼠肥大心肌细胞,利用三气孵箱建立缺氧/复氧模型以模拟缺血再灌注。应用RT-PCR、Westernblot、siRNA基因转染、Hoechst33258染色法检测AIF在mRNA和蛋白质水平的表达及细胞凋亡的变化,分析AIF在缺氧/复氧致肥大心肌细胞凋亡中的意义。结果如下:(1)与对照组比较,缺氧8h组(H8h)和缺氧12h组(H12h)AIFmRNA及蛋白表达水平均显著升高(mRNA:0.52±0.04及0.85±0.10vs0.29±0.08,P<0.05;蛋白质:2.07±0.15和3.12±0.19vs0.29±0.04,P<0.05),即随缺血时间的延长,AIFmRNA及蛋白表达水平均显著增加。(2)与对应单纯缺氧组比较,缺氧后给予复氧刺激,H8h/R组和H12h/R组AIFmRNA及蛋白表达水平均显著升高(mRNA:1.09±0.12和1.41±0.23,P<0.05;蛋白质:4.57±0.25和5.71±0.27,P<0.05)。仅在H8h/R及H12h/R组,可见AIF核转位显著增加。(3)AIFsiRNA转染可显著抑制肥大心肌细胞AIF的表达,对缺氧时细胞凋亡无明显影响(P>0.05),但可显著降低缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡率(P<0.05)。同时抑制AIF及caspase-3活性,可显著加强单一抑制剂对缺氧/复氧诱导的肥大心肌细胞凋亡的抑制作用。(4)抑制caspase-3活性对缺氧/复氧诱导的AIF核转位无明显影响。上述结果提示,缺氧/复氧时AIFmRNA、蛋白表达和核转位均显著增加,且在缺氧/复氧诱导肥大心肌细胞凋亡中具有重要的作用。     

尾加压素对新生大鼠心肌细胞一氧化氮合成的影响

应用半定量逆转录－多聚酶链反应法,观察尾加压素（urotensin Ⅱ,UⅡ）对培养的新生SD大鼠心肌细胞内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS)mRNA表达的影响,并测定UⅡ对心肌细胞内一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS)活性和一氧化氮（nitric oxide,NO)释放的影响。结果显示：UⅡ抑制培养的新生大鼠心肌细胞eNOS mRNA表达、抑制NOS的活性及NO释放;0.1μmol/L浓度的UⅡ呈时间依赖性抑制心肌细胞NOS的活性及NO生成。上述实验结果提示UⅡ的心血管作用可能与NO合成系统有关。     

血红素氧合酶-1/一氧化碳通路参与辛伐他汀抗高血压诱发的大鼠心肌肥厚

为了探讨他汀类药物抑制心肌肥厚的作用机制,本研究应用一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸[N-nitro-L-arginine, L-NNA,15 mg／(kg·d)]制备大鼠高血压心肌肥厚模型,并分别给予不同剂量辛伐他汀[5或30 mg／(kg·d)进行干预。6周后测大鼠左心室功能、左心室重量指数(left ventricular mass index,LVMI)、心肌脑钠素(brain natriuretic peptide,BNP)含量、心肌羟脯氨酸含量和心肌血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)活性。在体外培养的新生大鼠心肌细胞中,观察辛伐他汀对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)引起的心肌细胞肥大的抑制作用与细胞血红素氧合酶-1(HO-1)表达、HO活性及CO生成间的关系。结果表明,辛伐他汀干预明显减轻L-NNA处理大鼠的心肌肥厚(LVMI值、心肌BNP和羟脯氨酸含量均显著低于单纯L-NNA处理组),改善左心室舒张功能,而且心肌HO活性显著升高。在离体培养的原代乳鼠心肌细胞,辛伐他汀浓度依赖性地抑制Ang Ⅱ引起的细胞肥大(3H-亮氨酸掺入),并相应增加HO-1 mRNA表达、HO活性和CO生成量。应用HO抑制剂锌卟啉能有效抑制辛伐他汀抗Ang Ⅱ诱导的心肌肥大作用。结果提示:辛伐他汀上调HO-1／CO通路是其抗高血压诱发的心肌肥厚的机制之一。     

大鼠局灶性脑缺血后一氧化氮合酶基因表达的变化

目的:观察大鼠局灶性脑缺血后3种类型一氧化氮合酶(NOS)mRNA表达的变化.方法:大鼠随机分为正常对照组、缺血后2、6、12、24 h组,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测缺血脑组织NOS基因表达的变化.结果:脑缺血后eNOS、nNOSmRNA表达增强,分别于2、6 h达高峰;iNOS mRNA表达亦增高,但在缺血后12 h达高峰.结论:大鼠脑缺血早期eNOS和nNOS占主要地位,缺血后期iNOS占主要地位.     

siRNA干扰HIF-1α表达对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞的影响

目的 研究胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)和缺氧诱导因子1a(hypoxia inducible factor 1a,HIF-1a)在高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中的表达及其之间的关系;观察siRNA沉默HIF-1a基因对高糖高胰岛素诱导的心肌细胞肥大的影响.方法 新生大鼠心肌细胞培养48h后,换用无血清DMEM培养液并分别加入高糖高胰岛素、高糖高胰岛素+HIF-1a-siRNA培养48h,未加入任何药物的心肌细胞在无血清DMEM培养液中继续培养48h作为对照.通过心肌细胞表面积、总蛋白含量指标检测心肌细胞肥大,并利用Real time PCR检测转染前后HIF-1a mRNA表达变化及免疫细胞化学方法检测HIF-1a及IRS1蛋白水平的表达.结果 高糖高胰岛素可增加心肌细胞表面积、总蛋白含量、HIF-1a mRNA以及HIF-1a表达,并降低IRS1表达.转染siRNA后使HIF-1a基因的表达下降,能部分抑制心肌细胞的肥大,降低心肌细胞表面积和总蛋白含量,但对IRS1表达的影响不明显.在对正常对照组和高糖高胰岛素组中IRS1表达量与HIF-1a表达量进行相关分析表明,两者的表达量成负相关.结论 通过siRNA技术对HIF-1a的有效沉默可明显地抑制高糖高胰岛素诱导大鼠乳鼠心肌细胞肥大,并且这种作用可能是通过作用于IRS1/PI3K/ Akt/MTOR途径来实现的.