三种猕猴属动物Fas基因的克隆

从腹股沟淋巴结或血液中提取总RNA,根据人的Fas基因的cDNA序列设计上、下游引物,通过RT-PCR扩增出三种猕猴属动物Fas基因的cDNA片段,将片段克隆到pGEM-TEasy载体中,筛选阳性克隆并进行序列测定。恒河猴Fas基因编码序列为1005bp,GenBank收录号为AY007572;熊猴的编码序列为996bp,GenBank收录号为AF326208;短尾猴的编码序列为933bp,GenBank收录号为AF332357。对五种已知的灵长类动物的Fas基因进行序列比较,结果表明Fas基因的保守区域具有高度保守性,而处于编码序列中间的一段低复杂度序列在不同的物种间具有很高的变异性。 Abstract：Total RNA were extracted from inguinal lymph nodes o r blood.The Fas cDNA fragments of three macaca species were obtained by RT-P CR using the upper and low primers according to the Fas gene of human,and th en cloned into pGEM-T Easy vector.The positive clones were sequenced.For the fir st time we cloned the Fas genes of Macaca mulatta,Macaca assamensis and Macaca arctoides,the encoding sequences are 1005bp, 996bp and 933bp, respect ively.Finally we compared the sequences of Fas genes among five primate spec ies that have already been submitted to GenBank.The results confirmed the conser vation of regions in two ends of Fas genes,and the high variability of a low complexity region in middle of every Fas gene.     

猪Fas基因的克隆及序列分析

广西大学动物科技学院李军、李晓宁、杨坚和罗建荣四位科研工作者从pk-15细胞中提取总RNA,用RT—PCR方法扩增出猪Fas基因,将其克隆到PMD18-T载体上,再进行序列分析,结果表明：克隆的猪Fas基因序列与genBank上登录的猪Fas基因同源性为100％,与人、牛、羊的Fas基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73．4％、79．2％、76．4％和56．2％、67．0％、64．6％。Fas蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、牛、羊与人的基因中呈现较高的同源性。[第一段]     

人白细胞介素-36受体拮抗剂基因的克隆及序列分析

[目的]构建人白细胞介素-36受体拮抗剂(interleukin-36 receptor antagonist,IL-36Ra)的真核表达载体,并对其基因全长编码区进行分析。[方法]提取总RNA,逆转录出IL-36Ra c DNA序列。设计人IL-36Ra基因的上游引物和下游引物。利用热启动PCR扩增目的基因,将扩增出的IL-36Ra基因编码区通过限制性内切酶酶切后,把酶切的目的片段与载体pc DNA3.1连接,转化到感受态细胞大肠杆菌DH5α中。通过氨苄青霉素抗性筛选、双酶切及菌落PCR鉴定,最后选取阳性克隆进行测序。[结果]重组载体pc DNA3.1-h IL-36Ra经菌落PCR和酶切鉴定,最后通过序列分析证实,其序列与Gen Bank中数据一致。[结论]人IL-36Ra基因的重组真核表达载体pc DNA3.1-h IL-36Ra的成功构建,为进一步研究IL-36Ra在免疫性疾病中的作用奠定了实验基础。     

人、猴、兔BPI活性部位基因的克隆和序列分析

为比较不同动物来源杀菌／通透性增加蛋白（BPI）的活性部位在基因组成上的差异,为今后对人BPI进行分子改构打下基础,分别从人、恒河猴和家兔外周血白细胞中克隆出BPI全长或活性部位基因,进行序列分析和比较,并进行蛋白二级结构预测。结果发现：猴、兔BPI活性部位序列与人序列在核苷酸水平的同源性分别为94％和77％,在氨基酸水平的同源性分别为88％和62％;人氨基酸序列中包含一个糖基化位点,而猴、兔序列没有;兔序列比人、猴序列少一个氨基酸;3种BPI活性部位有近似的二级结构。     

木瓜凝乳酶基因的克隆及序列分析

通过设计一对特异性的引物,采用RT－PCR方法从未成熟的木瓜组织中扩增得到木瓜凝乳酶基因,并将其重组到pPIC9K载体中,转化大肠杆菌并筛选阳性克隆,序列测定并利用BLAST软件进行核酸及氨基酸序列相似性分析,结果表明：通过序列组成及特征结构分析,扩增得到的基因为木瓜凝乳酶基因。     

大花杓兰亲环素基因的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

甜荞胰蛋白酶抑制剂cDNA片段的克隆及序列特征

采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等方法从甜荞中纯化出荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsm inhibitor,BTI),经活性鉴定该抑制剂属丝氨酸类蛋白酶抑制剂家族。为了获得BTI的基因序列,并弄清其在体内的表达调控机制,应用RTPCR和3’-RACE等方法,直接体外扩增该抑制剂基因,首次获得总长为361bp的DNA片段(GenBank登录号为AY335158),并命名为BTI-W1。该片段包括一个183bp的开放阅读框,编码61个氨基酸。由该基因推导的氨基酸序列与已报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂BTI-2的氨基酸序列的同源性达100％。BTI-WI基因的获得,对于深入开展荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能关系的研究具有重要意义,也为荞麦植物资源的开发利用建立了前期研究基础。     

大花杓兰亲环素基因(CmCyP)的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

人神经生长因子基因的克隆及序列分析

以人基因组DNA为模板,采用PCR获得人神经生长因子(hNGF)基因,载体pGEM-T中,DNA序列分析克隆的hNGF基因与文献报道的完全一致。     

人IL-18 cDNA克隆及其真核表达质粒的构建

用ＲＴ－ＰＣＲ技术从健康人外周血单核细胞的总ＲＮＡ中扩增出编码白细胞介素１８的全长ｃＤＮＡ,并将此基因定向克隆入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３中,通过对转化子的筛选得到了带有ＩＬ－１８插入片段的阳性克隆,经酶切分析及核苷酸测序表明,克隆到的基因与文献报道的完全一致。把重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＩＬ－１８分别转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２和鼠肉瘤细胞Ｓ１８０,在ｍＲＮＡ水平检测到ＩＬ－１８的表达,但ＩＬ－１８ 的表达未诱导肿瘤细胞产生ＩＦＮ－γ。     

全雌系苦瓜ACC合成酶基因cDNA克隆及序列分析

以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为材料,根据已报道ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)保守氨基酸序列设计简并引物,采用RT-PCR技术及序列拼接,获得了全雌系苦瓜ACS基因cDNA序列,命名为Mc-ACS4(GenBank登录号:FJ459814)。该序列包含一个1 455 bp的完整开放阅读框,编码484个氨基酸,具有7个保守区;系统进化上与普通苦瓜ACS基因首先聚类,同源性达99%,二者仅有2个氨基酸差异,推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。     

蔓地亚红豆杉3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶基因的克隆与序列分析

3′-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶(DBTNBT)是催化紫杉醇生物合成最后一步反应所需要的酶,负责将带有不完全侧链的紫杉醇前体催化形成紫杉醇。利用蔓地亚红豆杉的总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆出DBTNBT基因的DNA序列和cDNA序列,测序结果显示长度分别为1465bp和1362bp,编码438个氨基酸的多肽。同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已经报道的蔓地亚红豆杉的DBTNBT氨基酸序列的一致性为96%。DNA序列和cDNA序列比对发现该基因含有1个内含子。利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其蛋白序列进行了分析,为利用基因工程的方法生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。     

两株真养产碱杆菌部分基因的克隆与序列分析

采用随机引物PCR技术从新建细胞培养室空气中获得两段长度414 bp及450 bp的片段.通过克隆测序及序列分析,结果表明,所测序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性分别高迭79%-83%及79%-84%,由其推导的氨基酸序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性高达86.4%-89.1%,由两分离菌株所获得基因片段推导的氨基酸序列之间的同源性高达98.1%,从而确定所分离两菌株为真养产碱杆菌不同亚型的菌株.     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

果胶酶基因片段的克隆及其序列分析

根据Genbank上登录的果胶酶基因序列设计三对不同果胶酶片段的引物,从本实验室已筛选的一株具有降解果胶质功能的细菌(暂编号为:C105)中克隆到了果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PE)基因片段。通过分析,PL基因片段与PE基因片段均与来源Erwiniachrysanthemi的果胶裂解酶和果胶甲酯酶基因的同源性很高,达到90%以上。     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

毛尖紫萼藓GpUCH基因克隆及表达分析

从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中筛选了一条与抗旱相关的泛素羧基末端水解酶基因的EST序列,采用RACE技术从毛尖紫萼藓中克隆出了该基因的cDNA全长序列,命名为白UCH。对该基因的序列特征、进化关系和表达谱进行了分析,为全面研究其功能奠定了基础。该基因cDNA全长951bp,开放阅读框711bp,共编码236个氨基酸。生物信息学分析显示,印UCH基因相对分子质量为25．7kD,等电点为4．67,为不稳定蛋白,属于跨膜蛋白但不存在信号肽。系统进化树分析表明,GpUCH与小立碗藓UCH蛋白一致性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GpUCH基因在复水和干旱的条件下均能表达,但是在不同的条件下表达情况差异显著。表明该基因可能在毛尖紫萼藓干旱过程中发挥一定的作用。     

水稻类受体蛋白激酶基因OsESG1的克隆与生物信息学分析

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase,RLK)在植物生长发育等多种信号的响应中发挥重要作用。以水稻基因组为模板,通过PCR方法,扩增到一条全长2.2 kb左右的目的片段,序列分析结合RT-PCR表明,该片段由一个完整的开放阅读框组成,无内含子,命名为OsESG1(GenBank登录号:HE 584611),其编码蛋白产物包含749个氨基酸残基。结构分析显示,该蛋白产物包含1个跨膜区、胞外S位点糖蛋白(SLG)、PAN_AP结构域和S_TKc结构域,属于S-结构域型类受体蛋白激酶,推测其在植物生殖发育过程中起作用。     

青岛文昌鱼过氧化氢酶基因的克隆及生物信息学分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶,是生物体内抗氧化酶体系的重要成员,因此本研究旨在克隆文昌鱼CAT基因并对其进行生物信息学分析。本研究以青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)为材料,用RACE技术首次克隆了其CAT全长cDNA的基因序列,命名为AmphiCAT(GenBank登录号:KU058636);该序列总长为2640 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1533 bp,编码510个氨基酸,含有一个长为19个氨基酸序列的潜在活性位点和一个长为9个氨基酸序列的血红素配体信号,总分子量在线预测约为57.85 kD;经生物软件分析确定该蛋白质无信号肽序列,预测该蛋白质为非分泌性蛋白,属于单功能CAT的clade3分支;该基因的分子进化树表明青岛文昌鱼CAT同软体动物的亲缘关系较近。