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相似文献
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1.
通过构建轻链二级库的方法,对人源抗TNF-α单抗Fab进行轻链置换,并筛选出具有更高亲和力的人源抗TNF-α单抗的Fab。首先用RT-PCR技术扩增正常人全套抗体轻链基因,并与已获得的人源抗TNF-α单抗的重链基因配对,构建人源抗TNF-α噬菌体抗体轻链二级库,然后筛选与TNF-α具有更高亲和力的克隆,经过三轮的生物淘筛(biopanning),获得了比原来的人源抗TNF-α单抗Fab具有更高亲和  相似文献   

2.
人α-肿瘤坏死因子基因的高效表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
用人工合成的α-肿瘤坏死因子(TNF-α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG间距离(D)各异。计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能,以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF-α可达菌体总蛋白的60%。密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF-α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc-  相似文献   

3.
人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建   总被引:2,自引:0,他引:2  
利用RT-PCR从人肥大前列腺组织钓取94个氨基酸的人前列腺分泌蛋白(PSP94)全长cDNA,序列分析结果与文献报道的完全一致.将PSP94成熟肽与人TNFα衍生物(TNFΔ)通过Linker-SAPGTP在基因水平上融合成5′PSP94-TNFΔ,融合基因DNA序列分析结果与设计的相符合.5′PSP94-TNFΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为31kD,表达量约占菌体总蛋白量的35%.以L929细胞和人前列腺癌细胞株PC-3为靶细胞进行细胞毒分析结果表明,5′PSP94-TNFΔ融合蛋白既具有TNF的细胞毒活性,又具有对前列腺癌细胞PC-3的杀伤作用  相似文献   

4.
针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上的白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将共与IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合,融合蛋白在大肠杆菌表达后,Westernblot分析表明,分子量约为37kD,活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有TNF抗肿瘤活性和结合IL  相似文献   

5.
内皮细胞E—选择蛋白的表达及p53基因的影响   总被引:3,自引:0,他引:3  
为探讨血管内皮细胞E-选择蛋白的表达及野生型p53基因对其表达的影响,采用流式细胞术及RT-PCR法分别测定其E-选择蛋白及其mRNA水平。结果表明:静息状态的内皮细胞表面检测不到E-选择蛋白的表达,尽管此时细胞内存在E-选择蛋白的mRNA。肿瘤坏死因子α(TNFα)可浓度依赖性地诱导内皮细胞表达E-选择蛋白,内皮细胞表面E-选择蛋白表达的增加伴随着细胞内E-选择蛋白mRNA水平的升高。TNFα刺  相似文献   

6.
用人重组肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)和人天然α干扰素(Interferon-α-,IFN-α)在人胚胎肺纤维母细胞(HEF)和Hep-2细胞系上对常见呼吸道病毒所致细胞病变抑制进行比较观察。病毒包括不同型别的腺病毒5株,单疱病毒Ⅰ型(HSV-I)1株,鼻病毒1株,仙台病毒1株,VSV1株。结果提示TNF-α和IFN-α均具有广谱抗病毒活性。TNF-α的抑毒作用能被TNF-α申抗和IFN-β单抗完全去除,被IFN-α单抗部分去除TNF-α的抗病毒效应。TNF--α中和试验的结果提示:TNF抗病毒活性仍为IFN-β诱生所介导。  相似文献   

7.
针对肿瘤坏死因子(TNF)在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素-6(IL-6)受体明显增高的事实,根据TNF结构与功能研究的最新信息,利用PCR技术,对人TNFα基因进行了改造,并将其与人IL-6成熟肽编码区cDNA通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后,Westernblot分析表明,分子量约为37kD;活性检测结果证实,该融合蛋白兼具有TNF抗肿瘤活性和结合IL-6受体的能力,在高表达IL-6受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的TNF高约3倍。  相似文献   

8.
bcl—2和IL—1和TNFα表达的调节作用初探   总被引:1,自引:0,他引:1  
通过将反义bcl-2基因转梁于U937细胞,建立了Bcl-2蛋白表达受抑的U937细胞模型,证实了模型细胞的增殖和存活表型授课和线菌素D-结晶紫试验和ELISA检测表明模型细胞上清中TNFα的活性和含量无明显变化,小鼠胸腺细胞增殖试验表明模型细胞上清中IL-1活性升高,提示bcl-2的表达对TNFα的表达无明显影响,但可能在一定程度上抑制了IL-1的表达或活性。  相似文献   

9.
本文利用PCR技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α(hTNFα)和白细胞介素6(hIL-6)成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体pBIT,并在大肠杆菌中得到了表达。SDS-PAGE的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的20%,其分子量约为37kD。活性检测证实,融合蛋白既有TNF活性,又有IL-6活性。  相似文献   

10.
通过RNA印迹分析和亚硝酸盐含量测定检查TNF-α、IL-1β和LPS对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达及NO生成的影响.结果表明,TNF-α、IL-1β和LPS均能显著诱导VSMCiNOS基因表达和促进NO生成,其作用强度与浓度和作用时间有关;双因素(TNF-α+LPS,LPS+IL-1β)对诱导iNOS基因表达及NO生成产生协同作用.PolymyxinB和地塞米松可部分抑制TNF-α对iNOS基因表达的诱导作用及NO生成  相似文献   

11.
老年大鼠单核/巨噬细胞分泌和表达肿瘤坏死因子增多   总被引:2,自引:0,他引:2  
为研究老年时肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌及表达的改变,在内毒素(LPS)1.0μg/ml刺激大鼠单核/巨噬细胞后,用酶联免疫法(ELISA)测定培养液中TNF-α含量,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCK)测定TNF-αmRNA。同时测定培养液中一氧化氮(NO)和前列腺素I2(PGI2)的含量。结果显示:老年鼠TNF-α分泌量及其mR-NA明显高于青年鼠。NO产量在老年鼠与青年鼠之间无明显差异。老年鼠PGI2分泌明显低于青年鼠。由于PG能抑制TNF-α释放,从而推测,PGI2产生能力的降低可能是老年大鼠单核/巨噬细胞TNF-α分泌量明显高于青年鼠的原因之一。  相似文献   

12.
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将这3个基因转录至同一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为5×105CFU/ml重组病毒分泌的细胞株,经PCR证明外源基因已整合至基因组,Northern印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,G418筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达TNF-α及IL-2。实验结果表明,含IRES的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。  相似文献   

13.
本文比较了Northernblot与原位杂交对大鼠腹腔巨噬细胞(M)TNF-αmRNA的检测结果。对照组Northernblot为阴性,而原位杂交则见胞浆内有一定量TNF-αmRNA存在;LPS(100ng/ml)刺激组,则两种方法均显示M转录TNF-αmRNA明显增多。Northernblot可对此作定量比较,而原位杂交则显示该mRNA在核周围相对较密。两种方法结合,可互相取长补短,以利更好、更全面地观察、分析某种基因变化。  相似文献   

14.
用PCR法获得了HBsAgpreS1(1-65)肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子(hTNFα)之后,插入表达载体PSB-92中,使融合基因的5′端直接置于大肠肝菌PL启动子下游,采用30℃培养,42℃诱导,获得了TNF与preS1(1-65)融合蛋白的表达产物。SDS-PAGE电泳显示表达产物为25kD,约占细菌总蛋白的35%。表达产物经Westernblot验证,能分别特异地与hTNFα抗体与preS1抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有TNF的生理功能(对L929细胞的细胞毒活性)。经DNA序列测定,preS1(1-65)肽基因正确地融合在hTNFα基因之后。该结果提供了一种制备preS1的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。  相似文献   

15.
通过RNA印迹分析和亚硝酸盐含量测定检查TNF-α、IL-1β和LPS对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)诱导型一氧化氮合酶基因表达及NO生成的影响,结果表明,TNF-α、IL-1β和LPS均能显诱导VSMCiS基因表达和促进NO生成,其作用强度与浓度和作用时间有关;双因素(TNF-α+LPS,LPS+IL-1β)对诱导iNOS基因表达及NO生成产生协同作用,PolymyxinB和地塞米松可部分凶制  相似文献   

16.
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质灰病毒的内核糖体进行位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒毒LTR启动子,将这3个基因转录至用一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆  相似文献   

17.
不同类型的细胞对于TNF-α诱志的细胞凋亡的敏感性可以有很大差别,但是多数的细胞在同时给予蛋白质合成抑制处理时会对TNF-α变得非常敏感。有学者认为有一个基因或一组基因在TNF受体活化后被诱导而传导细胞凋亡信号。近期的研究表明,一种被TNF激活的NF-κB转录因子在这一过程中起部分的作用。  相似文献   

18.
为探讨血管内皮细胞E选择蛋白的表达及野生型p53 基因对其表达的影响, 采用流式细胞术及RTPCR法分别测定其E选择蛋白及其m RNA水平。结果表明: 静息状态的内皮细胞表面检测不到E选择蛋白的表达, 尽管此时细胞内存在E选择蛋白的mRNA。肿瘤坏死因子α(TNFα) 可浓度依赖性地诱导内皮细胞表达E选择蛋白, 内皮细胞表面E选择蛋白表达的增加伴随着细胞内E选择蛋白mRNA 水平的升高。TNFα刺激内皮细胞后4 ~6 h ,E选择蛋白的表达达高峰。将p53 基因导入内皮细胞后, 经TNFα诱导的内皮细胞表面E选择蛋白的表达显著下降, 同时细胞内的E选择蛋白mRNA 的水平也明显降低。导入p53 基因不影响静息状态内皮细胞E选择蛋白的表达及其m RNA 的水平。提示: p53 基因至少部分通过降低E选择蛋白的mRNA 水平而抑制TNFα诱导的内皮细胞表面E选择蛋白的表达。  相似文献   

19.
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是介导白细胞与内皮细胞粘附的重要粘附分子.为研究野生型p53基因对内皮细胞ICAM-1表达的影响,分别采用流式细胞术和RT-PCR/HPLC方法测定ICAM-1蛋白及mRNA水平.静息状态的内皮细胞表面结构性地表达有少量的ICAM-1,在肿瘤坏死因子α(TNFα,10~1000U/ml)诱导下,其表达呈剂量依赖性增加.将p53基因导入内皮细胞,则显著抑制TNFα诱导的内皮细胞表面ICAM-1的表达.p53基因的导入对静息状态内皮细胞表面结构性表达的ICAM-1影响较小.p53基因主要通过降低ICAM-1的mRNA水平而抑制内皮细胞表面ICAM-1的表达,但对蛋白的抑制程度小于对mRNA的抑制程度.提示:p53基因对内皮细胞ICAM-1表达的影响除转录水平控制外,还存在转录后水平的调控  相似文献   

20.
用生物活性法和双抗体夹心桥联酶免疫吸附(ELISA)法检测了人类疱疹病素6型(HHV-6)GS株和南京地方株CN5,8,10感染的淋巴细胞培养上清中的肿瘤坏死因子(TNF)的水平,发现培养24h即可检出高水平的TNF,48~72h述到峰值,此后逐渐下降,与未感染耐照组比较有及其显著的差异(P<0.001)。GS株与地方株同诱生TNF水平无儿著性差异(P>0.1),三株地方株诱生TNF也无显著性差异(P>0.05)。TNF-α单抗可以完全中和培养上清中TNF的活性,证实上清中有TNF-α。与LPS比较,HHV-6诱生TNF-α的能力要强得多。  相似文献   

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