植物过氧化物酶超家族的分子结构

过氧化物酶广泛存在于生物中。基于序列相似性比较,可将真菌、细菌和植物来源的过氧化物酶归为一个超家族－植物过氧化物酶超家族。作者对近几年来植物过氧化物酶超家族的分子结构与功能研究进展,从过氧化物酶的辅基（血红素）微循环结构、过氧化物酶超家族的序列结构域,以及酶分子中底物结合位点和Ca^2＋结合位点的结构等方面作了简要评述。     

共转化大肠杆菌hemA和hemL基因增强小麦过氧化物酶WP1在原核系统中的功能性表达

小麦种子过氧化物酶WP1属于含血红素的植物Ⅲ型过氧化物酶,该酶不仅具有抗真菌活性,而且影响面粉加工品质。为提高WP1在大肠杆菌中的功能性表达,构建了用于提高大肠杆菌内源血红素合成,包含hemA和hemL基因的重组质粒pACYC-A-L,将其分别与包含WP1基因的分泌型和非分泌型表达载体pMAL-p4x-WP1与pET21a-MBP-WP1共同转化大肠杆菌T7 Express菌株;利用直链淀粉(Amylose)亲和层析柱纯化获得MBP-WP1融合蛋白,并以2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物检测重组WP1的催化能力。结果表明,含pACYC-A-L的宿主菌28℃诱导12 h后,培养液中5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)含量可达146.73 mg/L,卟啉类物质含量也显著上升。共转化pACYC-A-L和pMAL-p4x-WP1比单独转化pET21a-MBP-WP1获得的重组WP1的比活力提高14.6倍。该研究不仅成功地增强了小麦WP1在大肠杆菌中的功能性表达,同时为其他具有重要生物学功能并含血红素辅基蛋白的功能性表达提供了有益参考。     

管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液对黄粉虫过氧化氢酶基因表达的影响

为了探究管氏肿腿蜂Scleroderma guani寄生和注射其毒液对寄主黄粉虫Tenebrio molitor蛹中过氧化氢酶表达的影响,采用RT-PCR克隆黄粉虫过氧化氢酶基因,利用生物信息学软件分析基因序列结构特性,采用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达特征,使用试剂盒测定过氧化氢酶活性。克隆获得的黄粉虫过氧化氢酶基因编码阅读框序列长1 620 bp,编码539个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列中含有催化氨基酸位点(His-71、Asn-183和Tyr-393)以及过氧化氢酶家族的3个保守基序：近端活性位点序列(FDRERIPERVVHAKGXG)、NADPH结合位点(XXHQXXXXFXD)和血红素配体结合位点(RXFXYXDXH)。被管氏肿腿蜂寄生和注射其毒液后,黄粉虫蛹中的过氧化氢酶基因的表达量显著上调,其血淋巴和脂肪体中的过氧化氢酶活性显著升高。研究结果表明,管氏肿腿蜂毒液能调控黄粉虫过氧化氢酶基因的表达。     

细胞色素P450酶系与除草剂代谢

细胞色素P450是广泛存在于动物、植物和微生物体内的一类具有混合功能的血红素氧化酶系。它不但能够催化苯丙烷类、萜类化合物和脂肪酸等内源性物质的生物合成 ,而且参与许多外源性物质包括除草剂等的生物氧化。综述了代谢除草剂的细菌、哺乳动物和植物细胞色素P450酶系 ,概述了细胞色素P450酶系参与除草剂代谢的作用方式 :脱烷基化作用、环甲基化羟基化作用和芳环的羟基化作用等。这些细胞色素P450酶系在培育除草剂抗性作物、生物安全和生物修复方面表现出了巨大的潜能     

胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性位点的组氨酸残基的鉴定

为进一步研究胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性中心的特性,我们合成了放射性的16α-溴乙酸基孕酮和5α-二氢睾酮-17-溴乙酸酯作为亲和标记试剂。二者都是以不可逆的方式,活性位点定向地竞争性抑制酶的活性。当酶的浓度为1μmol/L,抑制剂的浓度为100μmol/L时,使酶失去一半活性所需时间(t_0.5)分别为75 min(16α-BAP)和480 min(5α-DTB)。当在反应混合液中有底物孕酮或5α-二氮睾酮存在时,可降低抑制剂对酶活性的抑制速度。把标记的酶用盐酸水解,用氨基酸分析仪进行分析,最后确定,位于酶的活性中心的被标记氨基酸为组氨酸,它可能在氧化还原反应过程中发挥着重要作用。     

几丁质酶及其在抗真菌病基因工程中的应用

真菌病是作物减产的主要原因之一。而植物界大量存在具有离体抑制真菌生长增殖能力的蛋白质,相应基因在转基因植株中表达,可使这些植物产生抗真菌能力。几丁质酶就是其中之一,它能催化几丁质（真菌细胞壁的重要成分）水解,从而抑制真菌的生长增殖。随着对其作用机理、生化特性、表达调控的深入研究,几丁质酶基因转化植株显示出很高的抗真菌能力,正日益成为植物真菌病防治的新途径。围绕几丁质酶在抗真菌病基因工程中的应用,本文对几丁质酶的活性底物、分类、生化及诱导表达、协同表达特性,进行了简要、全面的阐述。     

耐唑类药白念珠菌ERG11基因点突变

ERG11是唑类抗真菌药对白念珠菌作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶（14DM）的编码基因,ERG11基因的有义突变会使靶酶发生氨基酸置换,影响酶与药物分子的结合,是导致菌株耐药的原因之一。14DM具有特定的空间构型,突变所处的位置决定能否导致菌株耐药,已发现的60余种ERG11点突变里面,仅有数种被实验证实可致耐药。     

罗汉果环阿屯醇合酶的同源建模、分子对接及催化环化的机理推测

环阿屯醇为植物甾醇类化合物,也是诸多甾醇类化合物生物合成的关键前体物质之一,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节胆固醇等多种药理活性。课题组前期克隆了罗汉果环阿屯醇合酶基因(Cycloartenol Synthase,CAS)并对其进行了功能验证(GenBank登录号:HQ128566)。但该酶的催化活性位点及催化机制尚不明确,阻碍了进一步的改造及应用。本研究利用同源建模预测CAS的三维结构,结合分子对接模拟技术分析该酶与底物的相互作用,结果表明,Asp491、Cys492、Cys570、Tyr540、His265是CAS酶上关键的催化位点,Asp491质子化2,3-氧化鲨烯引发四个环化反应形成C20正离子中间体,然后中间体经过一系列的碳正离子重排形成C11正离子中间体,最后通过His265与Tyr540去质子化使得C27与C11原子间形成单键生成产物环阿屯醇。此外,活性空腔内存在大量的疏水氨基酸,则通过疏水作用稳定反应物、中间体结合在活性空腔。该酶活性位点的发现,为今后通过定点突变技术改造酶的活性及调控代谢通路奠定了基础。     

血红素蛋白疏水性的毫微秒荧光的研究

应用毫微秒荧光技术结合荧光探针方法研究牛血红蛋白、豆血红蛋白和辣根过氧化物酶同功酶等血红素蛋白辅基结合区域的疏水特性和构象变化,过氧化物酶活性中心的疏水性,构象变化和活性的关系.     

白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶三维结构分子模型研究

基于四种原核细胞色素Ｐ４５０晶体蛋白Ｐ４５０ＢＭ３、Ｐ４５０ｃａｍ、Ｐ４５０ｔｅｒｐ、Ｐ４５０ｅｒｙＦ模建白色念珠菌羊毛甾醇１４α－去甲基化酶三维结构。序列匹配采用四种晶体结构比较结果基础之上提出的细胞色素Ｐ４５０超家族蛋白基于结构知识的序列匹配方法。以Ｐ４５０ＢＭ３晶体结构坐标模建目标蛋白结构保守区主链结构,结构保守区侧链构象来源于四种晶体蛋白与模建蛋白对应残基同源性得分最高残基构象。模建结果用分子力学和分子动力学进行结构优化,模建结果蛋白采用Ｐｒｏｆｉｌｅ－３Ｄ图、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ图和疏水图分析确证结构的合理性。并根据模型推测与血红素辅基相互作用的残基、与氧化还原偶联蛋白作用和参与电子传递的残基、底物进出通道和活性位点的残基。这些研究结果为定点突变研究、抗多肽抗体结合实验等提供理论依据,为高效低毒抗真菌药物合理设计提供靶标。     

胱硫醚β合酶新型抑制剂的发现和机制研究

[目的]旨在发现胱硫醚β合酶(Cystathionineβ-synthase,CBS)的新型抑制剂并研究其作用机制。[方法]通过构建血红素结合位点缺失或氧化还原位点突变的CBS突变体(CBS_(70-413)和CBS C272A/C275A),基于该酶的测活方法和PLP荧光光谱分析,研究3个CBS新型抑制剂的抑制有效性及其分子作用机制。[结果]亲和纯化得到了有活性的CBS_(70-413)和CBS C272A/C275A突变蛋白以用于抑制剂的机制研究。研究发现,CBS_(70-413)突变体可高效拮抗这些抑制剂的抑制效果,而C272A/C275A突变则不行,提示这些抑制剂可与该酶的血红素结合位点结合而抑制该酶活力。进一步研究结果表明,它们可别构调控该酶辅基PLP的含量。[结论]3个抑制剂的分子作用机制为,通过与该酶的Heme位点结合,并通过该位点去别构调控PLP辅基与活力位点的结合,从而抑制该酶的活力。     

抗真菌药物增效剂的研究进展

近年来,真菌耐药发生率呈逐年上升趋势,真菌对氟康唑等氮唑类药物的耐药性最为严重,成为临床抗真菌治疗失败的原因之一.对于耐药真菌的治疗,往往采用加大剂量或联合用药的方法.此外,文献报道了一些植物提取物、小分子化合物能显著增强抗真菌药物对耐药真菌的敏感性,两个药物的协同作用有望成为治疗耐药真菌的新策略.该文结合近几年的研究报道,简要综述了抗真菌药物增效剂的研究进展.     

修饰血红素提高血红蛋白类过氧化物酶活性

利用苯酚或对羟基联苯对血红蛋白的血红素辅基进行化学修饰,将修饰后的血红素与脱辅基血红蛋白进行重组得到新的血红蛋白。以光吸收扫描分析修饰血红素和重组血红蛋白,证明新的重组血红蛋白构建成功。酶活力测定表明,修饰血红素得到的重组血红蛋白的类过氧化物酶活性都比天然血红蛋白的酶活力高,用对羟基联苯修饰血红素得到的重组血红蛋白的酶活提高明显,约是天然血红蛋白的1.6倍。     

真菌诱导的植物几丁酶蛋白

几丁酶,水解几丁质-真菌细胞壁的主要成分,该酶广泛存在于微生物和动植物中.近年来,植物几丁酶在植物抗真菌侵染过程中的作用和巨大的应用前景,已引起了人们的广泛关注.重点综述亲和组合、不亲和组合及内生菌根中真菌对植物几丁酶蛋白的诱导、几丁酶的组织细胞学定位及其抗真菌活性研究.     

鉴别杰多霉素生物合成后修饰氧化酶JadH中参与底物结合或催化的关键残基

JadH是羟化脱水双功能酶,参与杰多霉素生物合成中的聚酮后修饰反应,将2,3-dehydro-UWM6催化为dehydrorabelomycin。为了分析杰多霉素生物合成途径中后修饰氧化酶JadH结合、催化底物的关键氨基酸,构建了JadH与底物复合物的三维结构模型。利用该模型并结合JadH同源蛋白氨基酸序列比对分析,推测出JadH活性中心中可能参与底物结合或催化的关键氨基酸(R50、G51、L52、G53、F100、R221、I223、P295和G298)。通过定点突变及体外酶学实验对这些位点的突变体的催化活性进行评价,结果显示这些突变株活性均显著低于野生型,表明这9个氨基酸是JadH参与底物结合或催化的关键氨基酸。     

单核细胞增多性李斯特菌氨基肽酶Lmo1711体外表达及其酶活分析

对单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)lmo1711基因编码的氨基肽酶进行克隆表达与纯化,并研究该重组蛋白的体外酶学特性。首先通过生物信息学分析预测Lmo1711与氨基肽酶家族成员的亲缘关系及关键活性位点的保守性。利用SWISS-MODEL模拟预测该蛋白的空间结构;构建Lmo1711原核表达载体并转化入E.coli Rosetta中,诱导表达重组目的蛋白,并利用镍离子亲和层析方法纯化目的蛋白;以氨基酸-对硝基苯胺偶联物为底物,Lmo1711通过水解底物N端氨基酸残基产生游离对硝基苯胺单体,405 nm处检测吸光值对该产物进行检测从而分析Lmo1711的酶学特性。在此基础上系统研究Lmo1711对不同氨基酸残基底物的催化特异性,及不同金属离子对该酶活性的影响。经原核表达纯化获得49.3 kDa的重组Lmo1711蛋白,与预测分子量一致;生物信息学分析推测Lmo1711属于M29氨基肽酶家族,且存在保守关键氨基酸活性位点(Glu250、Glu316、His345、Tyr352、His378、Asp380);酶活分析显示,Lmo1711具有较强的氨基肽酶活性,针对不同底物的结合和催化能力差异较大,对亮氨酸残基的亲和程度最高;Lmo1711氨基肽酶活性具有金属离子依赖性,Co~(2+)、Cd~(2+)、Zn~(2+)等多种金属离子均能显著增强其活性,其中Co~(2+)的激活效应最显著。本试验首次发现并证实,单增李斯特菌Lmo1711属于M29氨基肽酶家族成员,具有较强的催化活性,且对金属离子具有不同程度的依赖性。     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

紫黄质脱环氧化酶的某些特性和研究方法

紫黄质脱环氧化酶是高等植物体内叶黄素循环的关键酶,它催化紫黄质脱环氧化生成花药黄质和玉米黄质,在这个过程中伴随着过剩光能的热耗散.文中主要对此酶的性质、功能、研究方法以及分子生物学等内容作了简要介绍.     

MehpH的生化与结构特性

[目的]本研究旨在系统探究环境因素对邻苯二甲酸单乙基己基酯水解酶（monoethylhexyl phthalate hydrolase,MehpH）活性的影响,模拟该酶的3D结构并分析活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用。[方法]根据标准的酶学实验验证了环境因素对酶活性的影响。该酶的基本结构分析由DNAMAN （2.1）分析所得,同时利用SWISS-MODEL对其3D模型进行预测,并通过PyMOL软件对相关结果作了可视化处理。Autodock工具,Swiss-Pdb以及PyMOL均用以酶与邻苯二甲酸单乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate,MEHP）的相互作用分析。[结果]该酶的初级结构与已报道Gordonia sp. P8219菌株中的酯类水解酶相似,该酶的最适温度与pH （分别为40℃和8.0）和菌株P8219有所不同;该酶在有机溶剂、洗涤剂和金属离子环境中表现出良好的稳定性;然而,其酶活受2 mol/L的Ni²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺和Zn²⁺离子,1 mol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）,0.5 mol/L的对氧磷,1 mol/L苯基醚（PGO）,2 mol/L焦碳酸二乙酯（DEPC）和5 mol/L的毒扁豆碱所抑制。丝氨酸水解酶中高度保守五肽基序GXSXG与催化三联体HSD结构均存在于该酶的编码序列中。根据分子对接结果,Thr152与Ser230在水解酶与其模板之间也显得更为保守,且与MEHP联系较为紧密（分别为5.8 Å和3.6 Å）,可能起着重要的催化作用。而MEHP与催化氨基酸残基Ser125、His291、Asp259并不十分靠近。[结论]YC-RL2中MehpH在有机溶剂、洗涤剂以及金属离子环境中具有稳定的生物活性,表明其具有良好的应用潜力。酶的结构及活性中心得到了初步的分析,对于催化机理及酶改造研究具有重要意义。     

条件致病真菌烟曲霉麦角甾醇合成通路遗传调控机制研究进展

环境中普遍存在的腐生性条件致病真菌——烟曲霉是引起人类侵袭性曲霉病的重要病原,因此,研究烟曲霉的致病机理,开发有效的治疗药物是全球关注的热点。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要成分,参与细胞内许多生物学过程,麦角甾醇合成通路中的羊毛甾醇14-α-去甲基化酶Erg11A (Cyp51A同源蛋白)是抗曲霉病唑类药物的重要靶点,其受到转录因子Srb A与CCAAT结合复合物(CBC)的协同调控作用。文中阐述了主要的抗真菌药物以及抗真菌唑类药物的作用靶点-麦角甾醇及其合成途径的遗传调控机制的研究进展,同时分析了烟曲霉产生抗性的机制,期望为认识烟曲霉耐药产生和研发新型抗真菌药物提供帮助。