木霉纤维素酶的诱导形成及其调节I.槐糖对木霉EA3-867纤维素酶形成的诱导作用

在槐豆荚提取液中分离到白色针状的槐糖结晶,该糖对拟康氏木霉(Trichoderma pseudo-Koningii Rafai) EA3-867的纤维素酶(C1和Cx)有强力的诱导作用。在纤维素酶活力,尤其是产酶速度上明显超过纤维素的诱导作用。槐糖的诱导作用与添加槐糖的时间和菌种有关,并受甘油强烈阻遏。在以纤维二糖(0．5％)为碳源培养时,木霉EA3-867也能较迅速地形成纤维素酶,但在EA3-867的甘油培养物中加入纤维二糖(5×10-3M)并不能诱导Cx酶。槐糖和纤维素对纤维素酶的诱导作用,无论在诱导胞外和胞内纤维素酶的成分上或从凝肢电泳图上,都十分相似。作者认为木霉EA,一867的纤维素酶形成同时受诱导一阻遏机制调节,并对组成型和诱导型的纤维素酶的作用,以及固体纤维素对纤维素酶可能的诱导机制作了推测。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅲ、葡萄糖母液和槐豆荚提取液对纤维素酶诱导效应的分析

葡萄糖母液对拟康氏木霉1096,木_3,EA_3-867和N_2-78的洗涤菌丝体的纤维素酶形成,有强力的诱导效应。用活性炭层析分离和纸谱分离证实,葡萄糖母液对纤维素酶的诱导效应主要是由于其中含有的槐糖杂质的缘故。龙胆二糖是葡萄糖母液中另一含量较高的杂质,但它对纤维素酶的诱导能力较槐糖低得多。槐豆荚提取液同样具有诱导木霉纤维素酶形成的作用。本文讨论了如何利用木霉纤维素酶形成的调节控制原理来加速和增加纤维素酶的产量。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节 Ⅳ.高产变异株纤维素酶合成调节的变化——酶活提高原因的初步分析

拟康氏木霉纤维素酶高产变异株EA_3-867和N_2-78在合成培养基琼脂平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上菌落明显缩小,生长变慢。但在蛋白胨酵母膏琼脂平板上,小菌落恢复成大菌落,生长速度同野生型菌株一致。EA_3-867和N_2-78在不同液体培养基中纤维素酶活力均显著高于野生型菌株1096和木_3。洗涤菌丝体的诱导测定也证明高产变异株的纤维素酶诱导活性有明显的提高。变异株和野生型菌株洗涤菌丝体诱导形成的纤维素酶组分,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱判断,未见明显差异,仅变异株中代表纤维素酶活性的蛋白带显著加深。高产变异株纤维素酶产量的增加是由于菌株对诱导剂敏感性的增加和对降解物阻遏敏感性的减弱。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节——Ⅴ.拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rafai)N_2-78洗涤菌丝体纤维素酶诱导形成过程中核酸代谢的变化

拟康氏木霉N_2-78洗涤菌丝体在槐糖诱导下合成纤维素酶(C_1酶、C_x酶和β-葡萄糖苷酶)的同时,RNA含量也发生有规律的变化。采用加核酸酶抑制剂和低温、快速抽提的方法,从槐糖诱导的N_2~-78洗涤菌丝体中提取总RNA,经寡聚(dT)—纤维素柱分离,得到含 Poly(A)的RNA。聚丙烯酰胺凝胶电泳和亲合层析分离证明,经槐糖诱导后,菌丝体中Poly(A)-RNA含量增加。     

培养条件对木霉形成纤维素酶的影响和两种形成纤维素酶的促进剂的初步观察

用液体培养法研究了木霉EA_3-867菌株纤维素酶形成的条件。在所测试的各种粗纤维材料中,稻草粉和黄豆皮的混合物(比例是4:6)是菌株纤维素酶形成的最好基质。若同时加入一些糖类,能显著促进纤维素酶形成。其中半乳糖效果最好,能使酶形成数量提高一倍或更多,葡萄糖和果糖也有一定效果。培养液的初始pH 6～7最有利于纤维素酶形成。稻草中存在着两种天然的纤维素酶形成的促进剂。一种是水溶性的,能和半乳糖起协同作用,共同促进纤维素酶形成。另一种是酯溶性的,不需加入糖类能单独促进纤维素酶形成。     

木霉纤维素酶的诱导形成及其调节——Ⅵ.拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii Rafai)N_2-78被槐糖诱导形成的纤维素酶组分的分离、纯化及性质

拟康氏木霉洗涤菌丝体被槐糖诱导形成的纤维素酶,经DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤和聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法,初步分离得到C_1酶、C_x酶和β-葡萄糖苷酶三个组分,其分子量经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,分别为67,000、62,000和42,000。C_1酶用聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、免疫电泳和超离心鉴定,已证明是匀一的组分,为糖蛋白,富含甘氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸和谷氨酸。纤维素酶的三个组分对天然纤维素、微晶纤维素和或磷酸膨胀纤维素的作用存在协同效应。研究了纤维素酶组分的热稳定性及pH稳定性。     

青霉的纤维素酶抗降解物阻遏突变株的选育

从土样中筛出一株生长快,产纤维素酶较高的斜卧青霉(Penicillium decumbens114-2)。能在全纤维素(hlocellulose)双层平板上形成清晰的透明圈。摇瓶培养的滤纸酶活可达8.8mg 葡萄糖/ml.h。 114-2菌株(其纤维素酶合成可为葡萄糖所阻遏)经UV和NG诱变处理后,在含葡萄糖的全纤维素平板上筛选到多株仍能形成明显透明圈的突变株。其中JN15和JU1在含葡萄糖的全纤维素液体培养基中,在残余葡萄糖浓度为 1％左右时,滤纸酶活可分别达到7.3 和13.9mg葡萄糖ml·h。这是出发株114-2和纤维素酶高产菌株木霉EA_3-867和QM9414所不能的。在不加阻遏剂的对比试验中,两个突变株的纤维素酶产量都比较高。其中,JU1的滤纸、CMC和棉花酶活分别达到33mg葡萄糖/ml·h,234mg葡萄糖/ml·h和86mg葡萄糖/ml·24h。     

分离植物原生质体的纤维素酶的制备及性质

EA_3-867纤维素酶是由绿色木霉变异株EA_3-867,用稻草粉发酵提取,经过饱和硫酸铵沉淀,分子筛脱盐,冰冻干燥制成的。酶制剂在水中溶解度高,酶活力较稳定,它含有纤维素酶(C_1,C_x)、果胶酶、半纤维素酶等组分,是一种比较理想的分离植物原生质体的复合酶。我们用EA_3-867酶制剂已从20多种植物材料中分离出大量完整的原生质体,并把烟草的叶肉组织或愈伤组织的原生质体培养分化成植株。EA_3-867纤维素酶制剂的成功制备为我国进一步开展植物原生质体和体细胞杂交等研究提供了有利条件。     

筛选最佳生物质材料诱导里氏木霉生产纤维素酶

本研究用小麦、芒草、水稻这三种低木质素突变株材料作为新型诱导物筛选的对象,对三种木质纤维素材料进行成分分析,然后利用它们分别作为诱导物诱导里氏木霉生产纤维素酶,对其诱导产生的酶活力,胞外蛋白含量,糖化能力进行比较。结果表明,对里氏木霉产纤维素酶诱导效果最好的是水稻H*14、芒草W56、小麦Q142。相比于玉米秸秆作为诱导物,水稻H*14单独诱导里氏木霉β-葡萄糖苷酶效果最好,β-葡萄糖苷酶酶活提高了75.2%,滤纸酶活提高了86.6%。相比玉米秸秆作为诱导物,芒草W56单独诱导里氏木霉木聚糖酶的效果最好,木聚糖酶酶活力提高了9.93%,内切葡聚糖酶酶活也提高了30.8%。相比玉米秸秆作为诱导物,小麦Q142诱导里氏木霉的外切葡聚糖酶酶活效果最好,里氏木霉的外切葡聚糖酶酶活提高了88.6%。本研究发现低木质素的木质纤维素材料作为诱导物对里氏木霉诱导产酶效果较好,并且促进真菌胞外蛋白的分泌,诱导纤维素酶酶系平衡分泌,使得纤维素酶糖化水解能力的提高。该研究为今后纤维素酶工业化生产提供参考和帮助。     

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)UV III纤维素酶合成的诱导与阻遏

拟康氏木霉 (T .pseudokoningii)TH经紫外诱变获得一抗高浓度葡萄糖阻遏突变株UVIII,纤维素酶产量显著提高。研究表明 ,UVIII对诱导物的敏感性增加了 10 0倍 ,并且对葡萄糖的吸收能力明显下降 ,导致部分解除了葡萄糖阻遏作用 ,这可能都是该突变株产酶提高的原因     

纤维素酶制剂活力的测定方法

由绿色木霉EA₃-867所制备的纤维素酶制 剂是一种复合酶,除了纤维素酶外,还有半纤维 素酶、果胶酶等。而纤维素酶本身又是一种多 组分酶,一般认为它包括有C₁酶、Cx酶和fl- 葡萄糖普酶^[1-3] C₁酶能使天然纤维素降解成 直链纤维素,而Cx酶能使直链纤维素分解成纤 维二糖等较小单位,纤维二糖等再经β-葡萄糖 普酶作用,生成最终产物葡萄糖。     

芽孢杆菌E2菌株纤维素酶形成条件的研究

芽孢杆菌E,菌株(Bacillus sp.strain E2)能在55℃下良好生长并在培养液中大量积累胞外纤维素酶(190 mu／ml培养液),所产生的纤维素酶为单一的CMCa se。对芽孢杆茁E2菌株产酶条件进行了研究． 该菌产酶的最适培养基装量为200ml/500mI三角瓶,最适起始pH为6 5,最适产酶温度为45℃,产酶高峰在培养时间8—12小时。E2菌株不能利用单一的无机氮源形成纤维素酶。酪蛋白是试验过的供E2菌株形成纤维素酶的最好氮源,其用量为3g／L。CMC—Na,纤维二糖,能作为碳源供芽孢杆菌E2菌株形成纤维素酶。高浓度的葡萄糖(8g／L)对芽孢杆菌E2菌株纤维素酶的形成有抑制作用。天然纤维素不能作为芽孢杆菌E2菌株形成纤维素酶的碳源。     

拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)UV Ⅲ纤维素酶合成的诱导与阻遏

拟康氏木霉（T．pseudokoningii)TH经紫外诱变获得一抗高浓度葡萄糖遏突变株UVⅢ,纤维素酶产量显著提高。研究表明,UVⅢ对诱导物的敏感性增加了100倍,并且对葡萄糖的吸收能力明显下降,导致部分解除了葡萄糖阻遏作用,这可能都是该突变株产酶提高的原因。     

果胶酶B_1及浓缩液剂型纤维素酶EA_3867的制备和应用

为了配合植物细胞工程和基因工程的研究,几年来进行了纤维素酶和果胶酶的试制工作。用自制的EA_3-867纤维素酶和B_1果胶酶能从50余种植物材料中分离出大量完整而有活力的原生质体。以往我们制备EA_3-867纤维素酶过程中采用的冷冻真空干燥机,价格昂贵、货源紧张,给大批量生产造成一定困难。为此,我们试制了浓缩液剂型纤维素酶EA_3-867和果胶酶B_1。现将试验结果报告如下。     

康宁木霉QF-02纤维素酶酶学性质的研究

对康宁木霉QF-02生产的纤维素酶的一般酶学性质进行了研究。该纤维素酶系中滤纸酶、羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶、β-葡萄糖苷酶的最适作用温度分别为55℃、65℃、50℃和70℃,最适作用pH为4.0-5.0;在40-50℃范围内热稳定性较好,24 h保温后的残留酶活在48.5%以上;在pH3.0-8.0范围内比较稳定,4℃保存24h后的残留酶活在75.7%以上。与几种商品纤维素酶相比,该纤维素酶对未处理和碱预处理稻草都表现出较强的糖化能力。     

EA_3—867纤维素酶的简易冷冻干燥法

近年来,为开展植物原生质体培养和细胞杂交研究,我们利用木霉EA_3—867菌株发酵,制备纤维素酶,并对该酶的性质进行了研究。酶制剂活力和质量不仅与菌株种类、发酵过程的条件等,而且与最后干燥方法有关。最     

绿色木霉粗纤维素酶液水解壳聚糖的研究

利用自制绿色木霉粗纤维素酶液降解壳聚糖制备低聚壳聚糖.采用粘度法、乙酰丙酮法和还原糖浓度分析,研究了温度、pH值及反应时间等因素对壳聚糖水解程度和产物相对分子质量的影响,并采用质谱法对水解产物进行定性分析.结果表明,粗纤维素酶液水解壳聚糖作用的最适pH为5.0、最适反应温度为50 ℃、最适反应时间为12 h.粗纤维素酶...     

绿色木霉ZY-1固态发酵产纤维素酶

利用筛选的绿色木霉ZY-1（Trichoderma viride ZY-1）固态发酵产纤维素酶,采用稻草和麸皮为底物,考察稻草与麸皮比例随发酵时间对产酶的影响。结果表明：底物中,在m（稻草）：m（麸皮）为0：5和1：4时,发酵48h,pH保持4．5左右,还原糖量急剧上升,胞外蛋白产量最低;仅以稻草作底物时,整个发酵过程中pH约为7,还原糖量最低,胞外蛋白产量较高而滤纸酶活、羧甲基纤维素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（β-Gase）酶活均较低;在m（稻草）：m（麸皮）为3：2时,发酵96h,滤纸酶活达最大值5．01U／g干曲;m（稻草）：m（麸皮）为1：4时,发酵96h,β-Gase酶活达最大值4．6U／g干曲;m（稻草）：m（麸皮）为4：1时,发酵72h,CMCase酶活达最大值6．01U／g干曲。因此,底物中存在适量的稻草和麸皮有利于Trichoderma viride ZY—1产纤维素酶。     

液态发酵条件下拟康宁木霉8985产纤维素酶能力初探

液态发酵条件下,以微晶纤维素为唯一碳源,比较了拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis 8985和里氏木霉T.reesei QM9414产纤维素酶的能力。8985发酵12 h开始产生纤维素酶,36 h时酶活达到产酶峰值的50%,此时QM9414尚未诱导产酶。测定8985发酵84 h时上清液中滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分别为1.06、3.62、1.80和6.67 IU/mL,分别是QM9414上述酶活的1.72、1.70、6.35和1.12倍。8985滤纸纤维素酶酶活的最适反应条件为pH 4.5,反应温度50℃,在Fe³⁺(≤4 mmol/L)和Cu²⁺(0–10 mmol/L)存在条件下酶活稳定。     

L-山梨糖提高木霉纤维素酶合成速率机制的研究

在0.5％葡萄糖-Mandels盐培养液中添加终浓度为0.5％的L-山梨糖,可使里斯木霉(Trichoderma reesei C 30)和拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii S38)的内切和外切β-1,4葡聚糖酶合成速率在培养的2天内提高4倍。与此同时β-葡萄糖苷酶的合成没有明显变化。L-山梨糖能明显抑制菌丝生长,但对葡萄糖的吸收没有影响,对菌丝分泌纤维素酶的机制影响不大。其对酶合成的促进可能主要是通过降低了菌丝体的生长速率。