人肺表面活性相关蛋白Al在酿酒酵母中表达、纯化及活性分析

将编码正常人肺表面活性物质相关蛋白A1基因的cDNA克隆至酿酒酵母的分泌表达载体pVT102U/α中,构建了重组质粒pVT102U/α-SP-A1,转化酵母宿主菌S-78,通过改变培养基的pH值水平,经摇瓶培养,SDS-PAGE结果显示,培养上清中SP-A1表达量达400mg/L以上,表达产物分子量为62kD和32kD.分别以二聚体和单体形式出现.ELISA和Western blot实验表明表达产物能被抗体特异性识别.生物学活性检测证实其具有调理肺巨噬细胞吞噬E.coli的功能.     

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CCRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S－78进行表达．培养物的上清用酶标(ELlSA)鉴定为阳性,而对照S－78、pVT102u／α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mg／L。表达产物经阳离子交按层析(CM—Sphadex C₂₅)和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N－端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。     

厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋白mcofp-3的真核表达体系,并获得足够的mcofp-3黏附蛋白进行后续研究,采用酵母表达体系对mcofp-3进行了重组表达。通过PCR方法克隆厚壳贻贝的mcofp-3基因,构建mcofp-3的酵母真核表达载体pVT102U/α/mcofp-3,鉴定结果表明,重组表达质粒pVT102U/α/mcofp-3由真核载体pVT102U/α和mcofp-3的成熟肽DNA片段组成,插入的mcofp-3成熟肽DNA片段与预期序列完全一致;采用LiAC转化法将重组表达质粒转化到S78酿酒酵母中,经过RT-PCR分析以及1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,重组的mcofp-3得到了成功的转录;发酵菌液经阳离子交换柱及高效液相色谱分离,以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明,重组的厚壳贻贝黏附蛋白分子mcofp-3得到了成功表达,表达...     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

节杆菌BT801 N-氨甲酰氨基酸水解酶基因的克隆与表达

通过PCR从质粒pUC18-169中扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因（hyuC）,置于原核表达载体pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pQE60-hyuC,并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量44kD处有一表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%,主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明,工程菌M15/pQE60-hyuC的N氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株Arthrobacter BT801和亚克隆DH5α/pUC18-169提高了52倍和72倍。在节杆菌BT801和大肠杆菌DH5α/pUC18-169的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15/pQE60-hyuC,可使乙内酰脲酶总比活分别提高8.1倍和3.0倍。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

单链胰岛素前体在酵母中的分泌表达及其转变成人胰岛素

将化学合成的单链猪胰岛素前体(PIP)基因和用聚合酶链反应得到的α交配因子前导顺序(αMFL)基因插入质粒pVT102-U的醇脱氢酶基因ADH1的启动子和3’终止顺序之间而生成质粒pVT102-U/αMFL-PIP.被pVT102-U/αMFL-PIP转化的酵母(Saccharomyces cerevistae)可表达单链前体并分泌到培养基中.前体在纯化后可通过胰蛋白酶的转肽作用转变成人胰岛素.纯化的人胰岛素具有全部活力并可结晶.人胰岛素的总收率为每升培养液25mg.     

一氧化氮和氧自由基诱导缺氧再给氧心肌细胞凋亡的bcl-2和p53信号通路研究

观察了心肌缺氧再给氧损伤的一氧化氮(nitric oxide, NO)和氧自由基机制. 新生Wistar大鼠心肌细胞置于95% N₂ /5% CO₂环境培养24 h, 然后置于95% O₂ /5% CO₂环境培养4 h造成缺氧再给氧心肌细胞损伤模型. 单纯缺氧组心肌细胞置于95% N₂/5% CO₂环境培养24 h, 但不再给氧. NO供体硝普钠(SNP, 5 mmol/L)、NO合酶抑制剂Nw-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME, 100 mmol/L)和其异构体Nw-硝基-D-精氨酸甲酯(D-NAME, 100 mmol/L)以及超氧化物歧化酶/过氧化氢酶(SOD/CAT, 各100 U/mL)分别于缺氧前加入培养基. 正常对照组心肌细胞置于95% 空气/5% CO₂环境下培养. 结果显示, 缺氧24 h能增加培养介质中NO, 硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)和乳酸脱氢酶(LDH)水平, 再给氧降低培养介质中NO和 水平, 增加TBARS和LDH水平. 缺氧上调bcl-2和p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 而再给氧下调bcl-2蛋白表达水平, 上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平. 同时, 缺氧增加心肌细胞凋亡率, 而再给氧增加心肌细胞坏死率. NO供体硝普钠(SNP)增加培养介质中 和TBARS水平, 下调bcl-2蛋白表达而上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 增加DNA断裂、凋亡及坏死细胞率. L-NAME和 SOD/CAT分别降低培养介质中 和TBARS水平, 它们均能上调bcl-2蛋白表达而下调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 抑制DNA断裂、凋亡及坏死细胞率, 而D-NAME则无此作用. 以上结果表明, 在缺氧再给氧所致心肌细胞死亡过程中, NO和氧自由基参与下调bcl-2蛋白表达水平和上调p53和p21/waf1/cip1蛋白表达水平, 相应地激发细胞凋亡程序, 并提示一氧化氮及氧自由基诱导心肌细胞凋亡的机制与调节 bcl-2和p53和p21/waf1/cip1信号通路有关.     

猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达

将去除信号肽的猪干扰素-γ（PoIFN-γ）基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后, 构建成pPIC9K-α-PoIFN-γ分泌型重组表达载体, 电转化导入毕赤酵母GS115中,经G418筛选后获得2株多拷贝插入的重组子。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,其表达量为108mg/L,占培养液总蛋白的60%。实验首次在毕赤酵母表达系统中实现了PoIFN-γ基因的分泌表达。     

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体P64a。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9 个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southern blot 检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。 实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。     

胆囊细菌L型

用非高渗透压培养基培养法从常规细菌学检查阴性的慢性胆囊炎胆囊组织、胆汁及胆石中分离细菌Ｌ型,获得了８６．０２～１００％的检出率。胆囊检出的细菌Ｌ型绝大多数是稳定Ｌ型,在常规细菌学培养基或Ｌ型高渗透压琼脂培养基上不能形成可见的生长现象。沸水浴１０分钟可杀死胆囊或胆结石中的细菌Ｌ型,多种抗生素能抑制胆囊细菌Ｌ型的生长。细菌稳定Ｌ型在胆囊中如此广泛存在,可能是慢性胆囊炎与胆囊结石的重要病因。     

纳米生物技术

纳米生物技术将纳米技术和生物技术有机集成 ,将成为现代生物工程的重要组成部分 ,简要介绍纳米生物技术中的纳米生物材料 ,生物芯片、分子马达、纳米探针等方面的最新进展。     

青春双歧杆菌DM8504菌株对荷瘤小鼠体内NO诱生作用的研究

应用处死的青春双歧杆菌ＤＭ８５０４菌株皮下免疫荷瘤小鼠,按Ｇｒｉｅｓ反应原理测定一氧化氮（ＮＯ）的含量。结果表明,双歧杆菌能提高荷瘤小鼠体内ＮＯ的含量,较对照组显著升高,肿瘤组织的坏死程度在处理组与对照组之间也具有显著性差异。提示：在双歧杆菌抗肿瘤作用中,除ＴＮＦ—α外,ＮＯ也发挥重要作用。     

鄱阳湖黄颡鱼生物学研究

本文对翻阳黄颡鱼种内性状变异,食性,年龄和生长,成熟系数,周年变化,繁殖力等生物学特性进行了研究,为进一步利用和增养殖黄颡提供了理论依据。     

海鞘中的抗肿瘤生物活性物质

本文综述了从海鞘中发现的约８０种具有抗肿瘤活性的化合物,包括其结构、活性、来源等。对其中较重要者的作用机理作了比较详细的介绍。     

沙门菌CWDMs脂代谢检测

采用毛地黄皂苷敏感试验和菌细胞胆固醇、甘油三脂及胆碱酯酶定性与定量分析法,检测伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌经L 型变异后形成的细胞壁缺陷突变株(CW DM )的脂类代谢活性,了解这些CW DM 变异的性质和探讨细菌细胞壁缺陷突变与细菌演变的关系。结果表明,沙门菌CW DM s 具有显著的胆固醇和甘油三脂代谢活性、对毛地黄皂苷高度敏感并且还具有与白色念珠菌相似的胆固醇和甘油三脂的含量,但未能检出胆碱酯酶活性。CW DM s返祖菌丧失了脂类代谢酶类和胞浆膜不含胆固醇,恢复了与其亲代细菌型相似的代谢特征。提示在沙门菌天然即存在有与脂类及胆固醇代谢相关的基因,细胞壁的缺陷导致这些脂类及胆固醇代谢基因活化,以致 CW DM s 能够表达固醇和甘油三脂代谢活性和胞浆膜含有胆固醇     

鸟类呼吸与发声的神经调控

鸟类的发声产生于呼吸过程的呼气相;呼吸与发声中枢控制通路间具有复杂的纤维联系,构成“发声通讯复合体”;前脑的ＲＡ是鸣禽协调呼吸与发声的高位中枢;脑干部的ＤＭ、ｎＲＡｍ、ＰＢｖｌ、ＩＯＳ、ＲＶＬ及Ⅻｔｓ等核团参与呼吸肌及鸣肌活动的调节,使呼吸与发声的配合准确、协调。     

小儿心肌炎血清抗MP—IgM测定的临床意义

本文报道８６例心肌炎患儿,同时测定血清抗ＭＰ－ＩｇＭ。结果２６例抗ＭＰ－ＩｇＭ≥１∶８０阳性反应（３０．２３％）。两组病例心肌酶测定无明显差异,但均明显高于正常对照值。揭示肺炎支原体可引起心肌炎。富士明胶颗粒凝集法测血清抗ＭＰ－ＩｇＭ是诊断肺炎支原体心肌炎的特异性方法。     

双歧杆菌防治鼠伤寒沙门菌感染的实验研究

目的　以小鼠为模型,研究双歧杆菌在体内对鼠伤寒沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ,ＳＴＭ） 感染的防治作用。方法　分别用大剂量悉复欢、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ 、生理盐水（ＮＳ） 给三组小鼠灌胃,再用ＳＴＭ 攻击,观察小鼠经上述不同处理前后肠道双歧杆菌数量和ＳＴＭ 攻击后粪便ＳＴＭ 培养阳性率,阳性标本ＳＴＭ 分离值及小鼠ＳＴＭ 感染率;同时用双歧杆菌、悉复欢、双歧杆菌加悉复欢分别治疗ＳＴＭ 感染的小鼠,观察并比较疗效。结果　１． 大剂量悉复欢使用可使小鼠肠道内双歧杆菌明显降低,而双歧杆菌灌胃则肠道双歧杆菌明显增多。双歧杆菌灌胃的小鼠粪便ＳＴＭ培养阳性率、阳性粪便ＳＴＭ 值明显低于用大剂量悉复欢和ＮＳ 的小鼠,小鼠ＳＴＭ 感染发病率也明显较低。２． 对于ＳＴＭ 感染鼠,双歧杆菌与悉复欢联合治疗效果最好。结论　１． 双歧杆菌在体内对ＳＴＭ 有拮抗作用;能预防和减少ＳＴＭ 感染发生;２． 在ＳＴＭ 感染时,先用悉复欢,再用双歧杆菌可以达到预期疗效,双歧杆菌对鼠伤寒沙门菌感染有辅助治疗作用。     

植物功能基因组学的研究策略

植物基因组学是一门研究植物基因组内基因与遗传信息是如何有机结合并如何决定其功能的一门科学。随着植物基因组计划的顺利进行 ,植物基因组学的研究已从结构基因组学转向功能基因组学。近年来 ,多采用高通量 (highthroughput,HTP)序列分析技术、大规模实验技术及计算机统计分析技术研究植物基因组功能。概述了植物功能基因组学的最新进展。