硫氧还蛋白的共价修饰

硫氧还蛋白是细胞中普遍存在的低分子量蛋白质,为生物体所必需。硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸组成硫氧还蛋白系统,调节细胞的氧化还原状态。硫氧还蛋白不仅维持细胞的氧化还原平衡,还具有抗凋亡及促进细胞增殖等功能。原核细胞的硫氧还蛋白仅含有两个半胱氨酸残基,真核细胞的硫氧还蛋白除了活性中心的两个半胱氨酸残基外,通常还有另外的半胱氨酸残基。这些半胱氨酸残基的共价修饰使硫氧还蛋白具有了更丰富的功能。硫氧还蛋白的共价修饰包括谷胱甘肽化、巯基氧化、亚硝基化和烷基化。     

受溶氧浓度调控的新型大肠杆菌表达系统

利用透明颤菌(Vitreoscilla sp.)的血红蛋白基因在大肠杆菌中的转录过程受环境溶氧浓度调控,在贫氧条件下基因转录被激活的性质,构建了一个在贫氧条件下能高效表达外源基因的新型大肠杆菌表达系统。该表达系统包括一个古血红蛋白基因启动子元件控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒的宿主菌GJ100和另一个T7启动子控制外源基因表达的质粒载体。研究结果表明大肠杆菌本身的硫氧还蛋白,原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白IgG结合区(ZZ),真核生物的蛇神经毒素融合蛋白,鲑鱼降钙素六聚体,人白细胞介素Ⅱ和人尿激酶原等基因均能在该系统中获得高效表达。重组蛋白表达的水平可达细胞总蛋白的30％以上。     

包涵体蛋白体外复性的研究进展

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时 ,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白 ,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠 ,才能够得到生物活性蛋白。近年来 ,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集 ,提高活性蛋白的产率。     

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达

大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白基因表达系统。因其遗传背景清楚,容易培养,能大规模发酵,并有大量可供选择利用的克隆和高效表达载体,而成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株。但是,许多外源蛋白基因在大肠杆菌胞内表达时,往往不能自发折叠卷曲生成有一定空间结构和特定生物功能的蛋白质,而是以一种不溶性的沉淀即包涵体的形式     

信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用

信号肽在蛋白分泌的过程中起重要作用,分泌性蛋白质合成后由信号肽引导其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中。可以利用因特网在线工具和信号序列捕获系统来判定基因序列中是否含有信号肽序列。外源蛋白的表达形式多为细胞内不溶性表达(包涵体),少数为细胞外分泌表达。利用信号肽来引导外源蛋白分泌可避免因包涵体复性带来的困难。研究表明,多种外源基因连接上信号肽后在原核表达系统如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达;信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统,以提高蛋白的表达量。     

人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达

目的:应用大肠杆菌原核表达系统高效表达人血清Q型对氧磷酶(PON1)。方法:从pBlueScript-PON1重组质粒中通过PCR扩增得到了人PON1基因,将其亚克隆至原核表达载体pBV220中,构建了重组表达质粒pBV220-PON1,转化大肠杆菌,获得表达菌株。结果:rhPON1重组蛋白以不溶形式存在于包涵体中。凝胶扫描分析表明,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的18%。包涵体经分离、变性、复性等步骤处理后,产物未显示酶活性。结论:原核表达的rhPON1以包涵体形式存在,实现了人PON1在大肠杆菌中的高效表达。     

利用融合蛋白EDDIE在大肠杆菌中高效表达抗菌肽Cecropin AD

本研究采用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)定点突变外壳蛋白(EDDIE)为融合蛋白,对抗菌肽Cecropin AD(CAD)基因进行了高效融合表达,获得了有抗菌活性的抗菌肽CAD。首先采用重叠PCR基因合成技术将编码抗菌肽的CAD基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE编码基因合成为e-cad融合基因,接着将融合基因e-cad采用定点同源重组的方法连接到载体pET30a上,构建成pETED表达载体,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)表达,表达的融合蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%以上。蛋白质在体外复性,融合蛋白中EDDIE自我剪切,产生抗菌肽CAD。抑菌试验表明抗菌肽CAD能有效地抑制大肠杆菌和藤黄八叠球菌的生长,并且对酵母菌的生长也有微弱地抑制作用。以EDDIE为融合蛋白是在大肠杆菌中高效表达抗菌肽的一种好方法。     

包涵体蛋白复性的几种方法

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。     

EGF-SEA融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

根据基因库中查到的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因序列和人体表皮生长因子(EGF)基因序列进行密码子优化,以适于大肠杆菌表达.人工合成SEA基因与EGF基因.将两目的基因克隆至原核表达栽体pFT22b中,经测序验证表明成功构建了重组表达质粒pET22b-EGF-SEA.将构建好的pET22b-EGF-SEA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达;SDS-PAGE分析表明融合基因EGF-SEA在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式得到了高效表达,产物相对分子质量约为44kDa,与理论值大小一致.包涵体经洗涤,变性、复性后用His Bind Kit进行分离纯化,所得蛋白纯度≥95%.高纯度EGF-SEA融合蛋白的获得为进一步研究其生物学活性及肿瘤治疗奠定了基础.     

促进原核表达蛋白可溶性的研究进展

以大肠杆菌为代表的原核表达蛋白系统具有操作简单、周期短、成本低、表达量高等优点而成为获得外源表达蛋白的首选方案.但外源蛋白在原核宿主中往往以无生物活性的包涵体形式存在,这限制了原核表达系统的广泛应用.随着对蛋白折叠动力学、参与蛋白折叠的酶和分子伴侣等认识的不断深入,科学家们通过诱导条件优化、宿主细胞改造以及使用融合标签...     

植物基因工程中人工启动子的研究进展

启动子是调控基因转录的一段DNA,也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性。采用人工构建的方法,有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。本文综述了人工启动子在诱导表达、组织特异性表达、高效表达等方面的研究进展。     

山羊β—酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1-β6.7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT－PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果：构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长5'端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。     

Expression of glucose transporters in cancers

It has been known for 80 years that cancer cell growth in an energy-related process supported by an increased glucose metabolism. This phenomenon suggests a need for a corresponding increased uptake of glucose across the plasma membrane through an enhancement in the glucose transporter proteins, SGLT proteins as well as GLUT proteins. The results of many studies have demonstrated that the expression of glucose transporters, especially GLUT1, is increased in a variety of malignancies. GLUT1 overexpression has been found to be associated with tumor progression. It was found that GLUT1 overexpression is associated with poor overall survival in various malignant tumors.     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

信号肽及其在蛋白质表达中的应用

分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。     

2个表达单元间相互位置和转录方向对表达的影响

目的:研究质粒表达载体中2个表达单元间相互位置和转录方向关系对表达的影响,找出利于2个表达单元表达的优化的相互关系。方法:以全抗体为研究对象,构建了轻重链方向不同的2种相互关系的单质粒表达载体pIRESdhfrA和pIRESdhfrB,转染CHO-dhfr-细胞后,对瞬时表达水平进行了比较。以pIRESdhfrA和pIRESdhfrB为基础,构建了瞬时表达载体pIRESdhfrA-sv40ori和pIRESdhfrB-sv40ori,在COS-7细胞中进行了瞬时表达水平的比较。构建了基于CHO定点细胞系的稳定表达细胞株,对pIRESdhfrA和pIRESdhfrB进行稳定表达水平的比较。结果:在CHO-dhfr-的瞬时表达水平比较中,pIRESdhfrB转染的细胞表达水平是pIRESdhfrA转染细胞的2.18倍。与pIRESdhfrA-sv40ori在COS-7细胞的瞬时表达水平相比,pIRESdhfrB-sv40ori是其表达水平的2.3倍。pIRESdhfrB-FRT构建的CHO定点细胞平均表达水平是pIRESdhfrA-FRT构建的CHO定点细胞的11.6倍。结论:在构建的真核细胞质粒表达载体pIRESdhfr中,2个表达盒的启动子头-头转录方向关系比头-尾方向关系更利于重组蛋白的表达。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

Activity of β-glucuronidase in Root Tips of Different Types of Transgenic Sugar Beet Plants

Expression of the -glucuronidase (GUS) reporter gene driven by the CaMV 35S, rolC, nos and mas promoters was assessed in the tips of 12 independent clones of transgenic sugar beet (Beta vulgaris) roots. Three questions were addressed: 1) expression pattern specific for a given promoter, 2) expression pattern variability, and 3) relationship between gene expression and cell differentiation. Characteristic patterns of tissue-specific expression were distinguished for each promoter. Striking differences, however, were found between some clones, bearing the same construct. Statistical analysis of the pattern variability proved that the variability is significantly lower within the construct than between constructs. rolC-GUS clones exhibited the lowest and CaMV 35S clones the highest pattern variability. Comparisons between the four promoters showed consistent GUS activity in areas playing a key role in tissue determination (the elongation zone) where cells switch from frequent mitosis and mostly isodiametrical growth, typical for the promeristem, to rapid elongation and differentiation. All of the clones were highly GUS-positive in the elongation zone of stele. Activity was commonly localised in the stele of the maturation zone for CaMV 35S, rolC and mas-GUS clones. CaMV 35S-GUS clones were highly active in the promeristem.     

哺乳类细胞基因表达系统

通过适当的设计,可以构建在哺乳类细胞中表达的质粒,将其导入哺乳类细胞后,可以有效地表达外源基因．文章主要就这类质粒的特征、分类及其研究进展等方面予以综述．