听毛细胞钙信号转导及其与细胞能动性的关系

应用激光扫描共聚焦显微镜和ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ双重荧光标记法,研究豚鼠耳蜗分离外毛细胞钙信号转导及其与细胞能动性的关系。外毛细胞受药物或机械刺激后,其钙信号起源于一侧质膜,可形成钙波传向全细胞,对其中１个ＯＨＣ测得传播速度为０．０２５－０．４７μｍ／ｓ。     

豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞及外指细胞钙成像

用ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ荧光比值作细胞内游离钙指标,用激光扫描共聚焦显微镜测定豚鼠耳蜗分离的内、外毛细胞及外指细胞的游离钙,并利用钙成像技术进行细胞形态计量。单个外毛细胞呈试管状。内毛细胞呈烧瓶状,有明显的颈部。外指细胞分为体部及指状突部。毛细胞的胞内游离钙浓度明显高于外指细胞。毛细胞的胞质、胞核及表皮板的游离钙浓度不同。外指细胞的细胞体与指状突的游离钙浓度也不同。本研究认为,有无颈部为区别分离的内、外毛细胞的重要标准,外指细胞可凭借其特异的指状突结构以资识别。内耳毛细胞及外指细胞胞内游离钙分布的不均一性可能与各部位生理功能不同有关。     

丁胺卡那霉素对耳蜗外毛细胞运动及胞内游离钙的影响

本文运用连续录像手段和荧光测钙技术研究丁胺卡那霉素对离体耳蜗外毛细胞运动及胞内游离钙浓度的影响。结果显示：（１）正常状态下外毛细胞内游离钙的荧光比值为１．３９±０．０９（ｘ±ｓｘ,ｎ＝１５）;从等渗环境进入低渗环境外毛细胞变短变粗（Ｐ＜０．０５,ｎ＝７。（２）丁胺卡那霉素（６．６７ｍｇ／ｍｌ）可使外毛细胞胞膜皱缩内陷,局部直径明显变细（Ｐ＜０．０１,ｎ＝１９）,即使在低渗环境中也难以恢复原状。（３）丁胺卡那霉素（３．２３ｍｇ／ｍｌ）可瞬间降低细胞内钙离子浓度,使荧光比值降低１４．６８±２．０５％（Ｐ＜０．０１,ｎ＝１２）。提示丁胺卡那霉素的耳毒性作用机制可能通过降低细胞内游离钙浓度,进而影响外毛细胞钙依赖性的“慢能动性”运动     

双重荧光染色监测听毛细胞游离钙

豚鼠耳蜗分离外毛细胞经fluo-3和fura-red染色后,用激光扫描共聚焦显微镜监测其胞内游离钙的空间分布和动态变化,以fluo-3/fura-red荧光比值大小指示游离钙浓度的高低。外毛细胞胞内游离钙呈不均匀分布,荧光比值分别为细胞质1.71±0.85,质膜1.61±0.75,表皮板1.47±0.65及胞核1.39±0.66,显示细胞质游离钙浓度最高而胞核游离钙浓度最低。静息状态下连续扫描时荧光比值变化小于0.1,而在受到机械刺激后荧光比值增加幅度达0.3—1.2。实验结果表明,fluo-3和fura-red双发射比例法能更准确反映听毛细胞胞内钙的空间分布和动态变化,第二信使钙可能参与了听毛细胞的机械-电换能过程,研究了换能过程中听毛细胞钙信号的时空模式。     

SNP抑制5-HT诱导的胞内游离钙浓度升高和内钙释放

用Ｆｕｒａ － ２／ＡＭ 荧光测量技术研究了５ － 羟色胺（５－ ＨＴ） 诱导的大鼠尾动脉平滑肌细胞胞内钙升高和一氧化氮（ＮＯ） 的抑制效应。实验表明, 胞外０ｍ ｍｏｌ／ Ｌ Ｃａ２ ＋ 时胞内静息［Ｃａ２ ＋ ］ ｉ 为２０ ．２±８ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ８） 。１０μｍｏｌ／Ｌ ５－ ＨＴ 可诱导出胞内钙库释放引起的瞬态［Ｃａ２ ＋］ｉ 升高,其峰值达２４５ ．７ ±７１．６ｎｍｏｌ／ Ｌ（ｎ ＝ ６） 。１０ － ７ ｍｏｌ／Ｌ 硝普钠（ＳＮＰ） 可抑制５－ ＨＴ 诱导的［Ｃａ２ ＋］ｉ 升高,其峰值浓度降为７５．１±３５ ．９ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ５） 。当细胞浴液含２．５ｍ ｍｏｌ／Ｌ Ｃａ２ ＋ 时,静息［Ｃａ２ ＋］ｉ为１１２ ．８ ±１０ ．３ｎｍｏｌ／ Ｌ（ｎ ＝ ５） , 这时１０μｍｏｌ／ Ｌ ５ － ＨＴ 可诱导［Ｃａ２ ＋ ］ ｉ 的峰值为２５２ ．３ ±８０ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ４） ,以及其后平台浓度为１４３ ．０ ±３７ ．６ｎｍｏｌ／Ｌ（ｎ ＝ ４） ,略大于［Ｃａ２ ＋］ｉ 为１１２．８ ±１０ ．３ｎｍｏｌ／Ｌ 的静息浓度,为外钙内流引起。１０ － ７ ｍｏｌ／Ｌ ＳＮＰ 也可抑制５－ ＨＴ 诱导［Ｃａ２ ＋ ］ｉ 平台相浓度。平台浓度由１４３ ±４７     

TFP刺激裂殖酵母细胞钙离子内流的质膜效应

ＴＦＰ（１０－１００μｍｏｌ／Ｌ）可引起裂殖酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）胞外Ｃａ２＋内流,ＴＦＰ浓度不同,促进Ｃａ２＋内流程度也不一样,５０μｍｏｌ／ＬＴＦＰ的促进作用最大。并且ＴＦＰ浓度越大,Ｃａ２＋内流出现峰值也越早,１０、２０、５０、１００μｍｏｌ／ＬＴＦＰ处理后,胞内总钙出现峰值时间分别为４５、４５、３０、１５分钟。胞外Ｈ＋浓度也会对ＴＦＰ引起的Ｃａ２＋内流产生不同影响,缓冲液的ｐＨ值为６．０时最有利于ＴＦＰ引起胞内Ｃａ２＋含量增加,碱性条件下ＴＦＰ的效果最不明显。由ＴＦＰ引起的Ｃａ２＋内流增加要比单一地增加外钙浓度效果好得多,ＴＦＰ在１０μｍｏｌ／Ｌ浓度的外钙条件下引起的胞内钙含量数值比１０００μｍｏｌ／Ｌ的外钙条件而无ＴＦＰＴ所引起的胞内钙含量还要高５３．９％。缓冲液中加入０．８％的钙离子通道阻断剂ＬａＣ１３或溶液中无葡萄糖的存在,ＴＦＰ的促进作用消失,说明ＴＦＰ促进Ｃａ２＋内流是通过钙离子通道来完成的并需要能量参与。     

细胞转化过程中胞内钙离子浓度的变化

使用钙离子荧光探针Ｆｌｕｏ－３ＡＭ和ＤＮＡ荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２联染细胞的方法,利用显微分光光度计ＭＰＶⅡ测量了两种温度敏感细胞—６Ｍ２和ｔｓＲＳＶＮＩＨ３Ｔ３－ＬＡ９０细胞及Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２和转化Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２细胞在不同细胞周期时相内钙的浓度,发现从Ｇ１期到Ｓ期到Ｇ２期,６ｍ２细胞当在３３℃培养时（转化状态）胞内钙的浓度〔Ｃａ＾２＋〕ｉ分别为８５．０,１３８．４２３９．０ｎｍｏｌ     

大鼠卵巢绒毛膜促性腺激素受体在CHO中的表达和扩增

本文报道了利用二氢叶酸还原酶放大系统将大鼠ＬＨ／ｈＣＧ受体（记为Ｆ－ｈＣＧＲ）及其胞外肽段（记为Ｔ－ｈＣＧＲ）在中国苍鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中的表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,Ｆ－ｈＣＧＲ为一条蛋白质带,其表观分子量为９２ｋｄ,而Ｔ－ｈＣＧＲ为３５ｋｄ和３７ｋｄ两条带。表达受体对其配基ｈＣＧ表现出高的亲合力,Ｆ－ｈＣＧＲ的解离常数为７×１０－９ｍｏｌ／Ｌ,Ｔ－ｈＣＧＲ为６．４×１０－９ｍｏｌ／Ｌ。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞可结合１２５Ｉ－ｈＣＧ,而表达Ｔ－ｈＣＧＢ者不结合１２５Ｉ－ｈＣＧ。这提示Ｆ－ｈＣＧＲ主要存在于细胞质膜表面上。表达Ｆ－ｈＣＧＲ的转染ＣＨＯ细胞能刺激。ｃＡＭＰ的形成,而表达Ｔ－ｈＣＧＲ者不能刺激ｃＡＭＰ形成。免疫荧光定位结果表明,Ｔ－ｈＣＧＲ主要分布于质膜的细胞质侧以及胞内其他一些细胞器膜上。用免疫亲和层析可以得到纯化的Ｔ－ｈＣＧＲ。     

用共聚焦显微镜观察ACh及ATP对豚鼠耳蜗外毛细胞Ca^2＋的调控

用激光扫描共聚焦显微镜研究了一般公认的耳蜗传出神经递质乙酰胆碱（ＡＣｈ）和三磷酸腺苷（ＡＴＰ）对豚鼠耳蜗外毛细胞（ＯＨＣｓ）胞内游离Ｃａ＾２＋浓度（Ｃａ＾２＋）的作用,ＯＨＣｓ用Ｃａ＾２＋敏感荧光染料Ｆｌｕｏ－３着色,胞内Ｃａ＾２＋的分布以细胞底部稍强。ＡＣｈ在ＯＨＣ底部引起Ｃａ＾２＋的缓慢上长并维持在一个较高水平。ＡＴＰ在整个ＯＨＣ引起一个急剧的Ｃａ＾２＋升高,升高幅度在ＯＨＣ顶部最大。随着ＡＴ     

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞进行了研究,结果表明：（１）新分离的正常ＯＨＣ呈术状,胞膜光滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,４小时内形态无明显变化。（２）全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,ＯＨＣ膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成。（３）利用全细胞记录方式得到的ＯＨＣ静息电位值为－２６±９ｍＶ．