痘苗病毒天坛株非必需区TA25R…TA36L的两步重组表达载体的构建

针对痘苗病毒天坛株非必需区ＴＡ２５Ｒ－ＴＡ３６Ｌ,构建了可去除ＴＡ２６Ｒ至ＴＡ３５Ｌ的１０个ＯＲＦｓ,并同时表达ＬａｃＺ的两步重组表达载体ｐＡ２４２７ＬａｃＺ。通过两种方法（一步重组和两步重组）获得了在该区域表达ＬａｃＺ基因的重组痘苗病毒ＲＶＡ２４２７Ｌdisplay status     

天坛株痘苗病毒载体研究与应用概述

1982年,文献首次报道外源基因成功在痘苗病毒WR株（小鼠嗜神经毒株）中获得表达,引起了中国科学家的极大关注。1984年,中国医学科学院病毒学研究所在朱既明院士的组织下成立了痘苗病毒基因表达载体研究协作组,提出使用天坛痘苗病毒疫苗株开发可用于人体的痘苗病毒基因表达载体的新思路。该研究历时10余年,成功构建了痘苗病毒天坛株高效表达载体,并广泛用于外源基因表达、基因工程疫苗研究、单克隆抗体研制和诊断试剂开发。本文简单介绍了该载体的研究及应用,并对载体疫苗存在的问题及发展前景进行了讨论。     

痘苗病毒天坛株4b启动子的转录效率

痘苗病毒天坛株４ｂ启动子的转录效率崔虹容敏清王芝山侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室,北京１０００５２）关键词痘苗病毒,４ｂ启动子痘苗病毒载体在多价基因工程疫苗的研制中十分重要,外源基因在重组痘苗中的高效表达主要依靠启...     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

复制缺陷型痘苗病毒天坛株的细胞生物学特性及复制缺陷机制探究

痘苗病毒减毒株作为基因表达载体,广泛应用于多种疾病的预防和治疗。复制缺陷型痘苗病毒天坛株(Non-replicating Tiantan vaccinia virus,NTV)作为一株高度减毒的痘苗病毒株,其生物学特性和复制缺陷机制还有待研究。探究NTV细胞生物学特性和复制缺陷机制。在不同种属和组织来源的细胞中测定NTV复制能力、细胞嗜性和毒力;Western Blot检测HeLa细胞中的NTV的A17/A27蛋白表达水平,Real-time PCR检测晚期蛋白A17/A27转录水平。NTV在BHK-21、CEF细胞中可有效复制和扩散,而在Vero细胞及人源细胞HeLa、2BS、Hep-2和143TK-中均不能有效复制;在HeLa细胞中,晚期蛋白A17和A27蛋白表达受阻,而转录水平基本不变。NTV是一株复制缺陷型痘苗病毒,在多种细胞中复制和扩散受限;NTV晚期蛋白A17和A27的表达受阻且与蛋白表达转录水平无关,初步判定蛋白表达受阻发生在蛋白翻译阶段。     

非复制重组痘苗病毒天坛株C-K缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究

将反向串联的痘苗病毒启动p11k和p7.5k表达结构引入非复制痘苗病毒质粒载体,得到非复制痘苗病毒表达载体pNEOCK11β75、pNEOCK7511β、pNEOCK1175和pNEOCK7511。利用载体pNEOCK11β75、pNEOCK7511β及pNEOCK11β75IL6和RVJ123重组病毒进行同源重组,分别得到非复制重组痘苗病毒RVJ123△11β75、RVJ123△7511β和RVJ123△11β75IL6。Southern-blot证实：重组病毒RVJ123△11β75 C－K片段间大片段基因的稳定缺失,同时β－半乳糖苷酸基因插入到缺失区内并稳定表达,不影响另外非必要区外源基因的表达,缺失区内两外源基因的表达夫相互干扰,并且缺失区内外源基因的转录方向对其DNA复制及蛋白表达以及另外非必要区基因的表达无影响。     

痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析

通过我国痘苗病毒天坛株(疫苗株)全基因组核苷酸序列的测定,对痘苗病毒基因组的一级结构进行了详细的分析,发现天坛株全基因组由189274个碱基对和碱基组成,与其它痘苗病毒株相比,在病毒基因组旁侧区限制性内切酶Hind Ⅲ-C,B及中央区Hind Ⅲ-A片段出现多个DNA片段的缺失和新的DNA片段的插入,这些片段中编码的某些多肽目前已知与病毒的生物学性状有关,对阐明痘苗病毒疫苗株与非疫苗株毒力上的差别及正痘病毒属成员的致病机理等方面的研究提供了线索.除此之外,有关病毒启动子、开放读码框架的分布特点、G+C含量及密码子使用频率等基因组结构特点的分析,也为研究基因表达的调控机制和利用该病毒作为载体进行基因工程重组疫苗的开发奠定了基础.     

汉滩病毒糖蛋白G1G2和核蛋白NP在痘苗病毒天坛株中的联合表达

以汉滩病毒７６／１１８株Ｍ、Ｓ片段分别插入转南粒ＰＪＳＢ１１７５的Ｐ１１和Ｐ７．５启动子下游,构建成重组质粒ＰＪＳＢ１１７．５Ｓ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ转染针重组质粒分别与痘苗病毒天坛株ＴＫｖｖ和表达Ｓ片的重线痘苗病毒ＶＪＳＡ１１７５Ｓ进行共转染,免疫酶斑和蓝白筛法筛选并纯化,得到了重组病毒ＶＪＳＢ１１Ｍ５Ｓ。Ｂｕｄｒ的选择压力试验表明,外源基因确定插入在ＴＫ基因区;ＰＣＲ及打点杂交证实了两个片     

我国痘苗病毒疫苗株(天坛)25kb核苷酸序列及其与非疫苗株(WR)差异的比较

本文就我国痘苗病毒疫苗株(天坛株TT)基因组的Hind Ⅲ-L、J、I、N、M片段及部分K、F、A片段,共24765bp的核苷酸序列,采用Sanger的双脱氧末端链终止法进行了测定。其中L片段全长4123bp,J片段全长5010bp,I片段全长6498bp,M片段全长2221bP,N片段全长1567bp。总体上AT较为丰富(65.6％),其中A、T、C、G各占32.9％,32.7％,17.4％,17.0％。 TT诛的核苷酸序列与已发表的非疫苗株(WR株)基因组中相同区段的核苷酸序列进行了对比。结果表明,在所分析的序列中,两株病毒在核苷酸水平上有0.42％的差异;其中2/3为同-Py(T或C)或Pu(A或G)间的转换,而且位于病毒基因组中央区域的核苷酸序列的变异小于侧翼区,核苷酸的变异基本上没有造成开放读码框架(ORF)数量和编码容量的改变。     

我国痘苗病毒天坛株基因组左端限制酶位点的变异

本文用分子杂交及酶谱分析的方法,证明了我国痘苗病毒天坛株基因组Hind Ⅲ Dc片段来自Hind Ⅲ C片段,是由于后者Hind Ⅲ酶切位点变异造成的。     

甲型肝炎重组痘苗病毒(VMS11HAV25)的构建及其某些生物学性质

将5′端经过剪切的甲型肝炎病毒全部开放读码框架cDNA连接于痘苗病毒晚期启动子P11下游,重组于痘苗病毒天坛株的HiodⅢM片段Spb Ⅰ位点获得了重组病毒VMS11HAV25。对其生物学性质的研究表明,该重组病毒诱生痘苗抗体的能力、对鸡红细胞的血凝性质、空斑大小及对温度的稳定性等均与原天坛株相同。重要的区别是,重组病毒在家兔皮内和小鼠脑内的毒力都比原天坛株低约1个对数。病毒在人胚肺二倍体细胞连续传15代的表达水平与传代早期者相同。连续传20代后提取病毒DNA做Southern blot杂交表明,甲型肝炎病毒基因仍稳定地存在于原插入位置。     

采用我国痘苗病毒天坛株载体表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D

木文从单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)基因组EcoRI H片段中分离出含有糖蛋白D(gD)基因的2.5kb DWA片段,插入带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的pJC—2质粒p7.5k启动子的下游,转染TK~-143细胞,获得带有HSV-1 gD基因的重组痘苗病毒。采用HSV-1 gD单克隆抗体免疫胶体金技术进行电镜观察表明,重组痘苗病毒感染的细胞内有特异性HSV-1 gD抗原.重组病毒免疫家兔后6周可产生明显的HSV-1中和抗体。     

痘苗病毒的复制与中间纤维的关系

应用细胞选择性抽提与核酸点杂交技术业示,痘苗病毒的DNA 存在于中间纤维-核纤层-核基质组分(IF-L-NM)中。进而用DGD包埋-去包埋和电镜放射自显影技术相结合,结果表明新合成的病毒的DNA 优先结合在中间纤维上。在此基础上采用DNA 与蛋白质的体外吸附杂交实验,进一步说明痘苗病毒DNA序列与中间纤维及某些核基质蛋白质有较高的亲和性。