肽的α-酰胺化研究进展

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,由酰胺化酶PAM催化完成.PAM是一个双功能酶,含有两个催化结构域：PHM和PAL,顺序催化酰胺化两步反应.PAM的ｍRNA和蛋白质具有多样性.作为活性肽生物合成途径中的限速酶,PAM的表达及活力水平具组织特异性,受激素及发育中的相关因素的调节.     

C-末端酰胺化酶的研究进展

Ｃ－末端酰胺化酶的研究进展王翔林（沈阳药学院沈阳１１００１５）Ｃ－末端酰胺化酶（Ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌα－ＡｍｉｄａｔｉｎｇＥｎｚｙｍｅ,ｃ－ＡＥ）,又称甘氨肽酰化单氧酶（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅα－Ａｍｉｄａｔｉｎｇｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ,ＰＡＭ,ＥＣ１．１４．１７．１３）是动物体内普遍存在的一种酶。     

大鼠α-酰胺化酶(α-AE)在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

α-酰胺化是神经和内分泌系统中许多生物活性肽重要的翻译后加工过程,C末端α酰胺基团的存在对于许多生物活性肽的生物活性极为重要。本研究通过PCR扩增获得了编码大鼠α-酰胺化酶的基因,以pET-30a为载体,重组质粒pET-A转化至 E.coli BL21成功表达了α-酰胺化酶。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化重组蛋白。该蛋白具有催化三肽底物((Dns-Tyr-Val-Gly)成为酰胺化二肽 (Dns-Tyr-Val-NH2)的酶活性,这表明重组蛋白是α-酰胺化酶,有可能用于生物活性肽的酰胺化研究。     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活怀表达及在体外酰胺化？…

将大鼠脑ＣＤＮＡ库来源的ＰＡＭ基因片段,经克隆重组,成真核表达质粒ＰＳＶ－ＰＡＭ〈并转染ＣＨＯ细胞,获得在ＣＨＯ中稳定表达活性型α－酰胺化酶的细胞株ＤＧＡＥ。 物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明。以α－Ｎ＿ａｃｅｔｙｌ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ为底物,该酶催化反应的Ｋｍ为１２．５μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１８０μｍｏｌ／ｍｇ／ｈ,而且催化反应中表现中有最适铜离子浓度     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶基因的克隆与表达

本文采用原位杂交及ＰＣＲ方法,从大鼠脑ｃＤＮＡ库中,筛选到３个大鼠甘氨肽酰化单氧酶（ｒＰＡＭ）基因片段。经ＤＮＡ全序列分析表明,它们跨越ｒＰＡＭ－２全部编码区。通过点突变、ＰＣＲ重组技术等,分别拼接出此双功能酶的ｒＰＨＭ（氧化酶）、ｒＰＡＬ（裂解酶）及其ｒＰＡＭ全酶基因,并构建了多种大肠杆菌表达质粒。经温敏诱导。高效表达了ｒＰＡＭ－Ｎ２６０片段,并制各获得阳性抗血清,可用于免疫检测天然或重组的ＰＡＭ。而ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果显示,ｒＰＨＭ和ｒＰＡＭ在大肠杆菌中均获得了表达,其中ｒＰＨＭ表达量占全菌总蛋白的１０％以上。进一步研究还发现,通过采用低温和加二价铜离子诱导表达,可提高ｒＰＨＭ产物的可溶性及稳定性。     

大鼠α-酰胺酶在变铅青链霉菌中的克隆及表达研究

α－酰胺酶（α－ａｍｉｄａｓｅ,α－ＡＥ）催化神经和内分泌系统中活性多肽的Ｃ－端酰胺化,多多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增获得编码α－酰胺酶的ｃＤＮＡ,并进行了克隆和测序。为了使α－酰胺酶能在链霉菌中分泌表达,将其ｃＤＮＡ与链霉菌酷氮酶酶（ｍｅｌＣ１）信号的编码序列融合得到融合ｍｅｌ／ＡＥ,将ｍｅｌ／ＡＥ插入链霉菌质粒ｐＩＪ６８０,获得重组质粒ｐＩＪ     

多肽酰胺化酶的结构与功能

C端酰胺化是许多神经内分泌多肽重要的翻译后加工过程,是在酰胺化酶的催化下分两步进行的,PHM和PAL分别催化这两步反应.PHM由两个结构相似的结构域组成,每个结构域均为九链β折叠组成的三明治样结构,分别由三个His或两个His和一个Met螯合一个Cu组成活性中心.在一个反应周期中,两个Cu分别独立地与抗坏血酸和分子氧发生单电子传递的氧化还原反应,最后完成多肽底物的α-碳的羟化反应.     

用毛细管电泳法进行C端酰胺化结构分析和酰胺化酶活？…

利用酰胺化基团与羧基在一定的缓冲液中表现出不同的电性和疏水性,建立了以毛细管电泳为基础的多钛Ｃ端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定的新方法。     

大鼠甘氨肽酰化单氧酶在CHO细胞中的活性表达及在体外酰胺化修饰中的应用

将大鼠脑cDNA库来源的PAM基因片段,经克隆重组,构建成真核表达质粒pSV—PAM,并转染CH0细胞,获得在cHO中稳定表达活性型口α-酰胺化酶的细胞株DGAE。表达产物为双功能酶,分泌至培养基中的酶活力远高于胞内。体外酰胺化加工研究表明,以α—N—acetyl－Tyr-Val-Gly为底物,该酶催化反应的Km为12．Sμmol／L,V_max为180μmol／mg／h,而且催化反应中表现有最适铜离子浓度和pH值范围。表达的双功能酶可直接用于合成的多肽和基因工程表达产物的酰胺化加工修饰。     

用毛细管电泳法进行C端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定

利用酰胺化基团与羧基在一定的缓冲液中表现出不同的带电性和疏水性,建立了以毛细管电泳为基础的多肽Ｃ端酰胺化结构分析和酰胺化酶活性测定的新方法。     

人修饰型降钙素和鼠酰胺化酶基因在昆虫细胞中的偶联表达

人降钙素 (hCT)是 32氨基酸的多肽激素 ,C-端为α脯氨酰胺结构 ,具有调节体内钙、磷代谢等许多重要生理功能。用重组昆虫杆状病毒表达系统 ,偶联表达合成的人修饰型降钙素 (hmCT)基因与GST融合基因和大鼠酰胺化酶 (PAM)基因 ,再用抗hmCT或抗PAM抗体 ,既检测到由昆虫细胞表达的GSThmCT产物也检测到PAM产物。经GSH 琼脂糖凝胶亲和层析 ,分离纯化GSThmCT融合蛋白。这种蛋白修饰酶与底物在真核细胞偶联表达也将适用于其他生物活性肽的体外表达     

新辅基吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成基因研究进展

吡咯喹啉醌（Ｐｙｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－Ｑｕｉｎｏｎｅ,ＰＱＱ）是氧化还原酶的新辅基。它在细菌体内是由一组排列成簇的相关基因即ｐｑｑ基因控制合成的。根据不同细菌来源ｐｑｑ基因的同源性和对应关系,可将ｐｑｑ基因归为７类：簇基因１～７。在Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ中存在其中四个,ＫｌｅｂｓｉｅｌａＰｎｅｕｍｏｎｉａｅ和ＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＯｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍＤＳＭ７６０中６个,而Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘ－ｔｏｒｑｕｅｎｓＡＭ１中存在全部７个簇基因。簇基因１编码一个由２２～２９年氨基酸组成的小肽,此小肽可能是ＰＱＱ的前体,簇基因２可能涉及ＰＱＱ跨膜转运,簇基因３可能负责ＰＱＱ合成的最后一步酶催化,簇基因５可能涉及ＰＱＱ合成中某种酶的辅因子合成,簇基因６和７可能负责小肽的加工。簇基因４功能还不清楚,但在Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓＡＭ１中簇基因３和４是以融合基因存在的。     

合酶与合成酶

合酶与合成酶是生化教学中经常提到的,同时也是比较容易混淆的两个概念。例如,对于三羧酸循环中催化乙酰ＣｏＡ与草酰乙酸反应生成柠檬酸的酶,国内教科书就出现了命名的混乱,有的书称为柠檬酸合酶,更多的书称为柠檬酸合成酶。此外,不少教科书把脂肪酸合酶、ＨＭＧＣｏＡ合酶、ＡＬＡ合酶及前列腺内过氧化物合酶误译成脂肪酸合成酶、ＨＭＧＣｏＡ合成酶、ＡＬＡ合成酶及前列腺内过氧化物合成酶等。可见,合酶与合成酶误用存在一定的普遍性。这种状况不仅使青年教师茫然,更使学生无所适从,实在有必要澄清。出现这种错误的可能原因一是名词的错…     

作物细胞耐旱保护酶系统对外磁场的反应

作物细胞的耐旱保护酶由过氧化物酶（ＰＯＤ） 、过氧化氢酶（ＣＡＴ） 和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） 组成。对小麦种子施加０．１Ｔ 的磁场处理使其萌发时细胞中ＰＯＤ 活性提高,幼苗根系和叶片细胞中的ＰＯＤ 活性也发生了变化,叶片的ＰＯＤ 同工酶谱中多出了两个酶带。使用蛋白质合成抑制剂和转录抑制剂发现,ＰＯＤ 活性提高的原因是磁场处理促进了ＰＯＤ 合成的翻译过程。干旱胁迫下,经磁场处理的幼苗叶片细胞中的ＰＯＤ、ＣＡＴ 和ＳＯＤ 活性均比对照高,膜脂过氧化产物丙二醛（ ＭＤＡ） 含量比对照低,表明保护酶系统的功能有所增强。     

硒代磷酸合成酶的研究进展

硒代磷酸合成酶（ＳＰＳ）的催化产物硒代磷酸（ＳＰ）是合成硒蛋白所必需的活性硒供体,所以ＳＰＳ可能对硒蛋白合成的调控起重要作用。近来发现ＳＰＳ广泛分布于哺乳动物、细菌和古细菌。ＳＰＳ菌化如下反应：ＡＴＰ＋硒化合物＋Ｈ２Ｏ→ＳＰ＋ＡＭＰ＋正磷酸。ＡＴＰ是该酶的特异性底物,ＡＭＰ是其竞争性抑制剂。该酶表现催化活性必需Ｍｇ＾２＋和一阶阳离子Ｋ＾＋等。     

Mg~（2＋）促进线粒体H~＋－ATP酶的重建机理──H~＋－ATP酶复合体亚基水平的研究

用专一性标记蛋白质巯基（－ＳＨ）的荧光探剂ａｃｒｙｌｏｄａｎ测定含Ｍｇ２＋的Ｆ０－ＡＴＰ酶或Ｆ０－ＯＳＣＰ－Ｆ１－ＡＴＰ酶的脂酶体的构象与无Ｍｇ２＋者明显不同,前者的蛋白质的－ＳＨ基团处于疏水性更强的微环境中;在有Ｍｇ２＋和ＯＳＣＰ同时存在下重建的Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶脂酶体较无ＯＳＣＰ者表现更高的水解活力或膜电位,表明ＯＳＣＰ增强Ｍｇ２＋的促进作用,这进一步提示Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态促进线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶重建的间接作用。这些实验结果,从线粒体Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的亚基水平的相关性上,对于我们提出的Ｍｇ２＋通过改变膜脂的物理状态使之具有合适的流动性,诱导嵌入脂双层的Ｈ＋－ＡＴＰ酶复合体的Ｆ０的构象发生变化并传递至复合体的催化中心Ｆ１,从而使重建Ｆ１－Ｆ０－ＡＴＰ酶具有较适合的蛋白构象,表现较高的重建酶活性的假设提供了直接的实验证据,精确地阐明了Ｍｇ２＋促进线粒体Ｆ０－Ｆ１－ＡＴＰ酶重建作用的分子机理。     

大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达

ａｒｏＧ基因编码的 ３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ　Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ＤＳ）和 ｐｈｅＡ基因编码的分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（Ｃｈｏｒｉｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ,ＣＷ／ＰＤ）都是本丙氨酸合成途径中的关键酶,为了通过基因工程手段来增加本丙氨酸生物的产量,在利用高效的原核表达载体ｐＢＶ２２ ０对ｐｈｅＡ基因编码的ＣＭ／ ＰＤ 酶进行了表达的基础上,采用ＰＣＲ方法扩增了抗反馈抑制的ａｒｃＧ基因,进行克隆表达,并与ｐｈｅＡ基因串联,以ＰＲＰＬ－ａｒｏＧ－ＰＬ－ｐｈｅＡ的形式,实现了２种酶基因在大肠杆菌中的表达, ＳＤＳＰＡＧＥ 图谱显示了新增的４３ｋｕ及３５ｋｕ蛋白带,经酶活性测定ＤＳ、ＣＭ／ＰＤ酶的比活分别提高了 ４．６７倍、８０５／１０．７１倍。     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。