可溶性CD14基因克隆及序列分析

针对人可溶性CD14(sCD14）的cDNA序列设计引物,通过反转录PCR技术,从U937细胞中,扩增出编码人可溶性CD14的基因序列,并将其克隆至质粒pGEM－T中,通过PCR、酶切及序列测定鉴定重组载体。结果表明获得了人可溶性CD14基因片段,为下一步进行CD14表达及生物学活性研究奠定了基础。     

人可溶性CD14基因克隆表达及功能研究

利用反转录PCR技术,从U937细胞总RNA中,扩增编码人可溶性CD14的基因序列,构建了重组表达质粒pEF1/HisC/sCD14^348aa;用脂质体转染法,实现了在真核细胞中的高效表达;用免疫亲和层析纯化表达产物,纯度达90％以上;PLS刺激U937细胞产生CD14的变化,证明了表达产物具有结合LPS的功能。     

重组人可溶性CD14在昆虫细胞表达系统中的表达

BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统是一种快速、高效、便捷的表达系统.将人可溶性CD14(sCD14)基因克隆入pFASTBAC1转移质粒中,重组质粒转化DH10BAC感受态细胞,目的基因通过同源重组插入BacmidDNA中,后者转染sf21昆虫细胞获得重组杆状病毒.利用重组蛋白C-末端的6×His@Tag,经TALON金属螯合色谱将重组病毒感染昆虫细胞获得的无血清培养上清--步纯化得到重组蛋白,计算表明从1L培养基中可纯化到约8mg纯度大于95%的重组sCD14蛋白,免疫印迹结果表明重组蛋白具有与抗6×His单抗和抗CD14单抗结合的抗原性.疑胶迁移实验和细胞活性实验表明重组sCD14蛋白能在体外与LPS结合,并能增强LPS诱导THP-1细胞产生细胞毒性因子.     

LBP／CD14系统及其与内毒素作用的关系

近年来,人们发现一组机体识别和调控内毒素（ＥＴ）作用的蛋白质分子：即ＬＢＰ／ＣＤ１４系统：包括血清脂多糖结合蛋白（ＬＢＰ）、细胞表面膜结合ＣＤ１４和可溶性ＣＤ１４。ＬＢＰ是ＥＴ的重要载体蛋白,ｍＣＤ１４是单核／巨噬细胞等ＣＤ１４＾＋细胞表面的内毒素受体,ｓＣＤ１４则是调节内皮细胞等ＣＤ１４细胞的重要介质。ＬＢＰ／ＣＤ１４系统能明显提高各种细胞对ＥＴ的敏感性,与脓毒症的发病机制有着密切的内在联系。     

人脂多糖结合蛋白基因的克隆及序列测定

采用PCR技术,从人肝cDNA文库中扩增获得了1.5 kb的脂多糖结合蛋白（LBP）的全长基因.序列分析表明,克隆的LBP基因编码的氨基酸序列与文献报道相同.     

LPS介导细胞激活的信号转导：从CD14到p38MAPK通路的研究

近年来对脂多糖（ＬＰＳ）介导细胞激活的信号转导过程已取得实质性进展,ＬＰＳ与血浆ＬＰＳ结合蛋白（ＬＢＰ）结合被运输到单核巨噬细胞表面,与ｍＣＤ１４受体结合起起细胞激活。ＭＡＰＫ参与了ＬＰＳ激活细胞产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）等活性物质的细胞内信号转导过程。ｐ３８ＭＡＰＫ对ＴＮＦ－α等细胞因子具有重要的调节作用。对ＬＰＳ激活细胞的信号转导研究呆能为治疗内毒素休克提供新的理论和思路。     

人神经生长因子基因的克隆及序列分析

以人基因组DNA为模板,采用PCR获得人神经生长因子(hNGF)基因,载体pGEM-T中,DNA序列分析克隆的hNGF基因与文献报道的完全一致。     

霍乱弧菌脂多糖O抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

经典生物型及埃尔托生物型霍乱弧菌的染色体DNA片段分别与载体质粒pUC18,B.S(M13~+)进行克隆,从克隆株中筛选到能表达霍乱弧菌脂多糖O抗原基因的重组子。它们所表达的脂多糖O抗原具有很好的抗原性及免疫原性,其重组质粒pMG-301、pMG-302经酶切分析表明,外源片段大小分别为8.4kb,7.6kb,较文献报道的16kb要小,而且基因结构之间也存在很大差异。     

人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区的克隆和序列测定

克隆人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区并进行序列测定。以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用RT-PCR方法得到人CD147的编码区cDNA,克隆至载体pcDNA3．1( )中,酶切鉴定后进行序列分析。结果获得人CD147编码区基因和重组质粒pcDNA3．1( )／asCD147,并经DNA序列分析证实其序列和献报道一致。以上结果证明了CD147在成骨肉瘤细胞中也有表达,为进一步进行其结构和功能研究打下了基础。     

人RP2基因的克隆,测序和初步表达

ＲＰ２是最近定位克隆的一个Ｘ连锁隐性的视网膜色素变性基因。用ＰＣＲ法直接从人视网膜ｃＤＮＡ文库中扩增以包括人ＲＰ２基因编码区的内在ｃＤＮＡ,先克隆到ｐＪＬＡ５０３载体中,随后将ＲＰ２编码区基因亚克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴａ中,并进行了ＤＮＡ序列分析。用ＩＰＴＧ诱导ｈＲＰ２融合蛋白在大肠杆菌ＤＨ５α菌株中表达,３０℃诱导１０ｈ后重组蛋白质约占菌体总蛋白质的７％,而３７℃诱导５ｈ后重组蛋白邓占菌体     

人RANTES基因克隆及其体外表达

1995年,Cocchi等[1]发现RANTES、MIP-1α和MIP-1β等β-趋化因子具有抗HIV-1感染活性.1997年,Feng等[2]和Deng等[3]证实β-趋化因子受体CXCR4和CCR5分别是HIV-1侵染T淋巴细胞和巨噬细胞的辅助受体(co-receptor).T淋巴细胞嗜性(T-tropism)分离株被称为X4毒株,巨噬细胞嗜性(M-tropism)分离株则被称为R5毒株[4].RANTES与CCR5有着高度的亲和力,二者的结合可对HIV-1的细胞附着产生空间位阻效应,并下调CCR5在细胞表面的表达.这一结果使RANTES抗HIV-1感染机制在分子水平上得到合理的解释.最近,Garzino-Demo等[5]证明,β-趋化因子的诱导分泌与HIV-1感染后疾病进程的控制有着密切的关系,而且人群中β-趋化因子水平存在着显著的个体差异,表明β-趋化因子对艾滋病具有潜在的预防和治疗价值.为此,我们在克隆人RAN-TES基因的基础上,在体外转录与翻译系统中实现了该基因的表达,有利于今后进一步开展艾滋病的基因治疗.     

水牛CD14 cDNA的克隆、表达及鉴定

目的:克隆水牛白细胞分化抗原14(buffalo cluster of differentiation antigen14,bCD14)基因,表达bCD14蛋白,并进行Western Blot鉴定.方法:采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bCD14基因,构建重组质粒pET28a-bCD14,转化入E coli BL21,IPTG诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析及Western blot鉴定.结果:bCD14基因含有一个1 122bp的开放阅读框,编码373个氨基酸;与印度水牛、挪威大鼠和人CD14的cDNA序列同源性分别为97.95%、68.78%、78.60%,氨基酸同源性分别为96.78%、61.27%、72.34%;主要以包涵体形式表达,表达蛋白经Western Blot鉴定,得到了一条约46 kD的特异性条带.结论:该文成功克隆了bCD14基因,表达了bCD14蛋白,为进一步揭示水牛抵抗革兰氏阴性菌感染的免疫机制奠定了基础.     

人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达

用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以人肝细胞总RNA为模板, 扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMnSOD)的cDNA片段, 将此cDNA克隆到载体pGEM-T中.对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定, 确定为含hMnSODcDNA的重组质粒将该hMnSODcDNA重组到表达载体pBV220内, 重组质粒在大肠杆菌DH5-α中表达hMnSOD, 表达产物占菌体总蛋白的14%, 具有持异性SOD酶活性.     

人MEPE/OF45基因的克隆及序列分析

目的：克隆人MEPE/OF45全长基因,为进一步研究MEPE/OF45在DNA损伤应答中的作用及特异的信号通路奠定基础。方法：选取人宫颈癌细胞HeLa为靶细胞,从中提取总RNA,设计扩增人MEPE/OF45基因片段的特异引物,进行RT-PCR分析;用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（CHX）对细胞进行处理,观察处理前后MEPE/OF45基因的表达情况。结果：在经CHX处理的HeLa细胞中扩增到了MEPE/OF45基因片段,随后利用重叠PCR方法获得了人MEPE/OF45全长基因,并经序列分析确证。结论：获得了人MEPE/OF45基因片段及全长基因,为阐明MEPE/OF45在细胞中复杂的功能提供了线索。     

豌豆外源凝集素基因的克隆及序列分析

从豌豆幼叶分离基因组ＤＮＡ,设计特异引物,用聚合酶链式反应方法扩增出豌豆外源凝集素基因并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＥｃｏＲＶ位点。进一步亚克隆至ｐＵＣ１９。序列分析表明,克隆到的片段大小为８３２ｂｐ,包含了豌豆外源凝集素基因完整的编码序列。该基因无内含子,同报道的已知序列相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为９９．６％和９８．９％。     

中国李PGIP基因的克隆及序列分析

以中国李叶片基因组为模板,PGIP基因保守序列为引物,扩增到1条全长1 192 bp的目的片段(Genbank登录号:DQ200847).序列分析表明:该片段与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP基因序列一致度达96%~99%,包含有1个完整的开放阅读框和1个内含子,其编码的氨基酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列;分子进化分析表明,在分子进化树中,该序列与杏、桃、马哈利樱桃、梅的PGIP序列位于同一类.为植物分子抗病育种提供了1条基因资源.     

人内皮抑素基因的克隆与序列分析

目的 :克隆与鉴定人内皮抑素基因功能区片段。方法 :采用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法 ,从人胎肝总RNA中扩增人内皮抑素基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,命名为pT hES ,并应用A377自动序列分析仪进行序列分析。结果 :成功克隆了人内皮抑素基因 ,经序列分析表明 ,所克隆的基因序列正确。这为利用基因工程技术生产重组蛋白奠定了基础。