山羊卵泡刺激素α亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的雌山羊脑垂体中提取总RNA ,反转录获得cDNA .以此cDNA为模板用PCR法扩增目的片段 ,获得长为 380bp的山羊卵泡刺激素α亚基cDNA片段 .将它克隆至pMD 18 T Verctor.随机挑选 3个阳性重组子进行测序 ,将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较 .结果表明 ,山羊卵泡刺激素α亚基基因氨基酸序列与绵羊、水牛的同源性最高 ,达 96 % ,与牛的同源性达 95 % ,与人的同源性较低 ,为 74 % .山羊卵泡刺激素α亚基基因编码区的核苷酸与绵羊的同源性最高 ,达 95 % ,与水牛、牛的同源性达 94 % ,与马和大鼠的同源性较低 ,为 85 % .总体来看 ,在哺乳类动物中FSHα亚基基因同源性还是很高的 .     

梅花鹿卵泡刺激素α-亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的母梅花鹿脑垂体中提取总RNA,反转录获得CDNA,以此CDNA为模板用PCR法扩增目的片段,获得长为380bp的梅花鹿卵泡刺激素α-亚基CDNA片段,它将克隆至PMD-18-T-Verctor。随机挑选3个阳性重组子进行测序,并将测序结果与绵羊、牛、猪等多种哺乳动物该基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列进行比较。结果表明,梅花鹿卵泡刺激素α-亚基基因编码的氨基酸序列与绵羊、水牛的该基因同源性最高,达97%,只有4个氨基酸不同;与牛的该基因同源性达96%。与人的该基因氨基酸序列同源性较低,为75%。其编码的核苷酸序列与绵羊、水牛、牛的同源性最高,达96%,只有14-16个碱基不同,与人的基因核苷酸同源性最低,为84%,总的来说,哺乳动物的卵泡刺激素α-亚基具有很高的同源性。     

甘蓝型油菜羧基转移酶α亚基全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中表达

通过分析拟南芥与大豆的羧基转移酶α亚基的cDNA序列,运用RT-PCR、RACE和基因组步行(Genome walking)三种技术进行组合克隆,首次从油菜开花后20～29天的幼胚中,克隆到质体定位的羧基转移酶α亚基的全长cDNA.同源性分析表明,其开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列与拟南芥、大豆的羧基转移酶α亚基的同源性分别为85%、59%.将此cDNA去除叶绿体转运肽编码序列的成熟肽编码序列,克隆到表达载体pHBM625上,蛋白质印迹分析,它在大肠杆菌中成功表达.     

褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基全长cDNA序列的克隆及分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆了褐飞虱NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基(NQO)基因的全长cDNA片段,并进行了核苷酸序列测定.结果表明,该cDNA片段长度为1930 bp,所编码的蛋白与家牛、小家鼠、食蟹猴、人和蟾蜍的NADH泛醌氧化还原酶51kD亚基的氨基酸序列的同源性分别达到77%、76%、76%、75%和75%.Southern杂交分析表明,NQO基因在褐飞虱基因纽中以单拷贝形式存在.     

中国南海石头鱼毒素NeoVTX的分离纯化、基因克隆及表达

目的:分离并鉴定石头鱼粗毒液毒性成分,克隆其序列并进行原核表达。方法:利用SDS-PAGE及凝胶过滤HPLC分离石头鱼粗毒液,质谱鉴定其序列;利用RACE技术钓取毒素基因;将获得的毒素cDNA连入pET-22b(+)载体,转化宿主细胞大肠杆菌,经IPTG诱导表达,用亲和层析纯化目的蛋白。结果:从石头鱼粗毒液中分离到NeoVTX等多种蛋白质,克隆了NeoVTXα和β亚基的cDNA序列,获得了纯度为95%以上的重组α亚基蛋白。结论:中国南海石头鱼粗毒液的主要成分为NeoVTX,其α、β亚基序列与日本冲绳海域石头鱼NeoVTX的α和β亚基具有很高的同源性;大肠杆菌菌株可稳定表达α亚基。该工作为NeoVTX抗体制备奠定了基础。     

乌拉尔图小麦（Triticumurartu）lAy高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的克隆与鉴定

应用简并性引物和基因组PCR反应从乌拉尔图小麦(Triticumurartu)不同种质材料中获得并测定了表达型和沉默型lAy高分子量麦谷蛋白亚基基因全长编码区的基因组DNA序列。表达型lAy基因编码区的序列与前人已发表的y型高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的序列高度同源,由其推导的lAy亚基的一级结构与已知的高分子量麦谷蛋白亚基相似。在细菌细胞中,表达型lAy基因编码区的克隆序列可经诱导而产生lAy蛋白,该蛋白与种子中lAy亚基在电泳迁移率和抗原性上类似,表明所克隆的序列真实地代表了表达型lAy基因的全长编码区。但是,本研究所克隆的沉默型lAy基因的编码区序列因含有3个提前终止子而不能翻译成完整的lAy蛋白。讨论了表达型lAy基因在小麦籽粒加工品质改良中的潜在利用价值以及lAy基因沉默的机制。     

珊瑚藻R-藻红蛋白γ亚基基因的克隆(英文)

根据珊瑚藻(Corallina afficinalis L.)R-藻红蛋白γ亚基N末端部分氨基酸序列(P83592)设计简并引物,结合RACE方法,扩增获得g亚基的全长cDNA序列。结果表明,序列全长为2308 bp(AY209894),5′非编码区长1203bp,3′非编码区长145 bp,编码区长960 bp,编码320个氨基酸组成的前体,包含71个氨基酸构成的信号肽和249个氨基酸组成的成熟蛋白。成熟蛋白序列内部存在重复序列与前人的报道一致。珊瑚藻亚基cDNA序列不同克隆子的测序结果表明,g亚基cDNA序列存在不同的3′末端,说明该基因可能存在多个拷贝或存在转录后加工。此外,扩增获得g亚基DNA序列(AY308999),比较表明编码区内部没有内含子存在。本文是对珊瑚藻R-藻红蛋白g亚基基因序列的首次报道。     

珊瑚藻R-藻红蛋白γ亚基基因的克隆

根据珊瑚藻(Corallina afficinalis L.)R-藻红蛋白γ亚基N末端部分氨基酸序列(P83592)设计简并引物,结合RACE方法,扩增获得g亚基的全长cDNA序列.结果表明,序列全长为2 308 bp(AY209894),5'非编码区长1 203bp,3'非编码区长145 bp,编码区长960 bp,编码320个氨基酸组成的前体,包含71个氨基酸构成的信号肽和249个氨基酸组成的成熟蛋白.成熟蛋白序列内部存在重复序列与前人的报道一致.珊瑚藻亚基cDNA序列不同克隆子的测序结果表明,g亚基cDNA序列存在不同的3'末端,说明该基因可能存在多个拷贝或存在转录后加工.此外,扩增获得g亚基DNA序列(AY308999),比较表明编码区内部没有内含子存在.本文是对珊瑚藻R-藻红蛋白g亚基基因序列的首次报道.     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.     

乌拉尔图小麦(Triticum urartu)1Ay高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的克隆与鉴定(英文)

应用简并性引物和基因组PCR反应从乌拉尔图小麦(Triticum urartu)不同种质材料中获得并测定了表达型和沉默型1Ay高分子量麦谷蛋白亚基基因全长编码区的基因组DNA序列。表达型1Ay基因编码区的序列与前人已发表的y型高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的序列高度同源,由其推导的1Ay亚基的一级结构与已知的高分子量麦谷蛋白亚基相似。在细菌细胞中,表达型1Ay基因编码区的克隆序列可经诱导而产生1Ay蛋白,该蛋白与种子中1Ay亚基在电泳迁移率和抗原性上类似,表明所克隆的序列真实地代表了表达型1Ay基因的全长编码区。但是,本研究所克隆的沉默型1Ay基因的编码区序列因含有3个提前终止子而不能翻译成完整的1Ay蛋白。讨论了表达型1Ay基因在小麦籽粒加工品质改良中的潜在利用价值以及1Ay基因沉默的机制。     

乌拉尔图小麦(Triticum urartu)1Ay高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的克隆与鉴定

应用简并性引物和基因组PCR反应从乌拉尔图小麦(Triticum urartu)不同种质材料中获得并测定了表达型和沉默型1Ay高分子量麦谷蛋白亚基基因全长编码区的基因组DNA序列.表达型1Ay基因编码区的序列与前人已发表的y型高分子量麦谷蛋白亚基基因编码区的序列高度同源,由其推导的1Ay亚基的一级结构与已知的高分子量麦谷蛋白亚基相似.在细菌细胞中,表达型1Ay基因编码区的克隆序列可经诱导而产生1Ay蛋白,该蛋白与种子中1Ay亚基在电泳迁移率和抗原性上类似,表明所克隆的序列真实地代表了表达型1Ay基因的全长编码区.但是,本研究所克隆的沉默型1Av基因的编码区序列因含有3个提前终止子而不能翻译成完整的1Ay蛋白.讨论了表达型1Ay基因在小麦籽粒加工品质改良中的潜在利用价值以及lAy基因沉默的机制.     

牛脑液泡型质子泵70kD和33kD亚基基因的表达

已分离了编码牛脑液泡型质子泵的70kD亚基的cDNA,利用聚合酶链反应(PCR)扩增了70kD亚基的编码片段,同时直接从牛脑cDNA库中得到了33kD亚基的编码片段.分别将相应片段连接到PET载体上完成70kD和33kD亚基基因在大肠杆菌中的表达.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明70kD和33kD亚基基因均得到明显表达.     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

牛Irak-1基因的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆提供了一种利用基因组数据库克隆新基因全长cDNA序列的策略。利用小鼠Irak-1基因编码序列(NM_008363)为种子序列进行电子克隆获得了牛Irak-1基因完整编码序列。然后,用生物信息学方法分析了该基因的结构,微卫星位点,密码子偏性和氨基酸的同源性等。结果表明:该基因cDNA全长2 645bp,无内含子,最大开放阅读框2 157bp,编码718个氨基酸,与小鼠的同源性为77%。     

东北虎促卵泡激素和促黄体激素基因的克隆及其序列分析

本研究首次从东北虎（Panthea tigris altaica)脑垂体提取总RNA,利用RT－PCR技术扩增出东北虎垂体促性腺激素α亚基,促卵泡激素（FSH）β亚基和促黄体激素（LH）β亚基的编码区序列,并进行克隆,测序和比较分析。结果表明,其α亚基,FSHβ亚基,LHβ亚基基因的开放阅读框分别为363bp,390bp和420bp,分别编码120,129和142氨基酸的前体蛋白。与已发表的人,牛,绵羊,猪,大鼠,小鼠等物种相应序列比较,无论在核苷酸水平,还是在氨基酸水平都显示出较高的同源性（64．7％－96．6％）,其中与猪的同源性最高（86％－96．6％）。东北虎的基因序列还具有其明显的特异性,首次发现LHβ亚基cDNA编码的前体蛋白在信号肽部分比其它物种相应序列多一个亮氨酸残基（Leu)。     

恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达

目的对恒河猴tPA编码区cDNA进行测序和表达.方法采用RT-PCR方法从恒河猴淋巴细胞中扩增tPA基因,将获得的cDNA克隆于T载体,序列确定后再克隆至真核表达载体.结果测序结果表明恒河猴tPAcDNA编码区与人tPAcDNA编码区的核苷酸序列同源性为96%,由此所推导的氨基酸序列的同源性为97.5%.随后将恒河猴tPAcDNA克隆于真核表达载体,转染CHO细胞后成功表达出了有活性的tPA.培养上清检测结果显示其活性约为50?U/ml,略低于人tPA在CHO细胞中表达产物的活性.结论本研究首次报道了恒河猴tPA基因编码区的全长cDNA序列并获得了有活性的恒河猴tPA真核表达产物.将为进一步比较灵长类动物间tPA的生物学特性奠定基础.     

蒙古绵羊 tnp1基因cDNA全编码区的克隆及序列分析

过渡蛋白1基因(tnp1)是圆形精子细胞特异表达的基因.绵羊tnp1基因的DNA序列至今尚未报道.为了开展绵羊圆形精子细胞标记基因的研究,根据其他物种tnp1基因cDNA的保守序列设计引物,从成年蒙古绵羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法,克隆了蒙古绵羊tnp1基因cDNA全编码区.该基因cDNA 长246 bp,包含一个168 bp的ORF,编码含有54个氨基酸的多肽链.DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为94.0%.绵羊tnp1基因的cDNA克隆和序列测定为进一步研究绵羊精子发生过程奠定了基础.     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。