两栖动物酒精标本DNA模板的快速提取

本文以中国角蟾属4个种的蝌蚪酒精固定标本为材料,取尾部肌肉组织0．1g,滤纸吸干组织块表面的酒精,在研钵中用剪刀剪碎,液氮研磨成粉(必要时可加少量石英砂),转入1．5ml离心管,加入1．0ml提取缓冲液(0．5％SDS,10mmol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA,pH8.0),37℃温浴h,5000r/min离心10min,取上清转入另一1.5ml离心管,氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次,上清液加2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA,12000r/min离心3min,无菌条件下风干后,50μl TE溶解,4℃保存备用。以通用引物PCR扩增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段并测序。本文不采用蛋白酶K提取酒精保存标本的DNA模板,全部流程只需3个小时,可同时提取数十个乃至数百个标本,并且所提取的DNA模板适合短片段PCR扩增。     

大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化

目的:简化操作流程,缩短提取时间,降低试验对操作者的危害。方法:该方法去除酚、氯仿等有害试剂,采用LiCl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸(包括DNA和RNA);工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA的提取过程中蛋白质的去除,而且可使质粒的拷贝数进一步增加,提高质粒DNA产量的目的。结果:实验改进方法所提取的质粒DNA产量高于常规方法,达到20μg/mL。结论:改进方法提取的质粒DNA,其下游的内切酶消化,PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意,完全可用于一般的分子生物学研究。     

碱裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质.本文适时加入较高浓度的RNA酶和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体.该法操作简单、经济、实用.     

昆虫病毒重组质粒的快速提取

质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50％,SDS 5％,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电     

非洲菊基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增模板浓度优化

以改良的CTAB法为基础,对非洲菊基因组DNA提取进行了下述优化：在第二次用氯仿,异戊醇抽提时,加入“PCN”溶液(0.0675g PVP,45μl 10％ CTAB 4％NaCl),可明显去除多糖;在材料研磨时加入化学物质M(0.1000g Na2SO3,0.0500g Vc)及N(0.0200gVE,0.1000gNa2B4O7,0.0200gPVP,200μlB-巯基乙醇),都可去除酚类物质,明显提高DNA及ISSR-PCR扩增的质量,但N的效果稍优于M;同时加入M、N及“PCN”,具有明显的优化效果,所提5个样品DNA,平均A260/A280、A260/A230分别为1.81、2.02,浓度为0.649μg/μl,片段大小约为49kb,ISSR扩增带多且清晰、明亮、稳定性及多态性高,表明DNA纯度很高。对扩增反应的最佳模板浓度进行研究表明,所提DNA模板必须稀释30倍(浓度为15～30μg/μl时),才能扩增出清晰的谱带。     

实验11 哺乳类基因组基因文库的构建

一、哺乳类DNA部分酶切片段的回收 1.选定所用的限制性内切酶。将待酶切的哺乳类细胞DNA分别装入6—10个Eppendorf离心管。 2.将限制性内切酶加入装有DNA的离心管。酶量逐级递减,例如1单位/微克DNA,0.5单位/微克DNA,……,37℃保温3—5小时。 3.或将相同的酶量加入装有DNA的离心管,37℃保温。经不同时间终止酶切反应。例如,保温10分钟,20分钟……。     

体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质粒

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质粒pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K12HB101(recA~-r(?)m(?))为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质粒。利用环丝氨酸浓缩Ap~rTc~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120株无性繁殖系为Ap~rTc~s。随机挑出3株含有重组质粒的无性繁殖系进行大肠杆菌素El(colicin El)免疫特性测定及显微镜观察,证明为大肠杆菌素El敏感,并为典型的大肠杆菌形态。随机挑出一株含有重组质粒pAG-5的无性繁殖系,采用Zasloff等酸酚法进行重组质粒DNA提取,用Hind Ⅲ消化重组质粒DNA后进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察到重组质粒pAG-5除pBR322质粒DNA带外含有λ-Hind Ⅲ的第5 DNA带。用重组质粒DNA再次对HB101(recA~-r(?)m(?))及K12 802(Su_(11)~+m_K~+)受体进行转化,转化体在含氨苄青霉素培养基平皿上生长,但在含四环素培养基平皿上不生长,再次证明为Ap~rTc~5.每微克重组质粒DNA Ap~r转化体为4.0—4.6×10~3。     

碳裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质,本文适时加入较高浓度的RNA和适当延长冰浴时间,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA,不仅达到了分子生物学实验要求,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体,该法揉作简单,经济,实用。     

农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法,得率较低,一般在50ng/μl以下。针对常规碱裂解法的不足,利用含有pCGⅡ双价载体的LBA4404菌株通过增加菌液收集量、改变提取流程中的反应条件等对常规方法进行了改良,去除了酚、氯仿提纯过程,减少了提取过程对人体的伤害,得率一般在0.5-2μg/μl。所提取质粒DNA可直接用于PCR、限制性酶切等分子生物学试验。     

三种樟科植物的细胞总DNA提取

为了从富含次生代谢物的樟科植物肉桂、锡兰肉桂、阴香中获得高质量DNA ,研究和改进了CTAB法、高盐低pH法和尿素法。改进方法包括 :1)在裂解液中加入 2 % β -巯基乙醇和 5 %PVP ,以防止氧化褐变的发生 ;2 )在酚 :氯仿抽提前加入 1 5mol L醋酸铵冰浴处理 ,能降低DNA的黏性。所得DNA的质量和产量经电泳、紫外吸收A2 60 A2 80 、PCR扩增和限制性内切酶酶切检测 ,结果表明改进法提取的DNA质量要比常规法的好。其中改进的CTAB法获得的DNA纯度最高 ,能用于PCR扩增和限制性内切酶酶切 ,是提取这 3种樟科植物总DNA的最佳方法。     

大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达

本文用穿梭质粒载体pSE-3,进行了大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中的克隆与表达。把含有1.6kb葡萄糖异构酶基因的pX1200(4.3kb)质粒与pGEM-3(2.9kb)质粒分别用EcoRI酶解,T4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101(Xy1~-,Neo(?)),得到的重组质粒被命名为pX1203(7.2kb);将pX1203与穿梭质粒载体pSE-3分别用HindⅢ酶解,T_4DNA连接酶连接,转化E.Coli HB101,在含有新霉素的木糖培养基上筛选到转化重组体,其重组质粒被命名为pSE×100(10.6kb);把pSE×100转化变铅青链霉菌TK54的原生质体,在硫链丝菌肽(50μg/ml)和新霉素(50μg/ml)的平皿上得到了重组体。经质粒提取,酶切分析,再转化和葡萄糖异构酶活性测定,结果表明,大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因确实已在链霉菌中克隆和表达。     

口服脂质体包裹Ag85A DNA疫苗诱导抗体的产生

制备脂质体包裹的Ag85A口服DNA疫苗,并观察小鼠口服后所诱生的抗体产生情况。用脂质体包襄重组质粒pcDNA3．1／mye—HisA—Ag85A制备口服DNA疫苗,并用脂质体包裹空质粒pcDNA3．1／myc—HisA作为对照。将C57BL／6小鼠随机分为3组,即生理盐水组、空质粒组和重组质粒DNA疫苗组。分别将生理盐水、空质粒和重组质粒DNA疫苗以灌胃方式投给各组小鼠,共免疫3次,每次间隔14d,末次免疫后14d处死小鼠,ELISA法检测血清中Ag85A特异性抗体水平,放射免疫法测定肠组织中分泌型IgA（sIgA）含量。重组质粒组血清中Ag85A特异性抗体滴度为1：160,空质粒组和生理盐水组血清中均未捡出Ag85A特异性抗体。重组质粒组肠组织中slgA含量（0．3761±0．0456）μg／mL较空质粒组（0．2374±0．0414）μg／mL和生理盐水（0．1993±0．0899）μg／mL组显著增高（P〈0．05）,而空质粒组和生理盐水组未见有意义的变化（P〉0．05）。口服脂质体包裹Ag85ADNA疫苗可诱导外周特异性抗体的产生和肠道黏膜局部sIgA的水平的升高。     

λ DNA酶切片段与pUC19克隆载体的构建与鉴定

目的:构建λDNA片段/p UC19重组质粒并鉴定。方法:将克隆质粒p UC19和λDNA进行Hind III酶切、碱法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳纯化鉴定、紫外分光光度测定,T4DNA连接酶切产物、冰Ca Cl2转化E.coli DH5α菌株使之成为感受态细胞、蓝白斑筛选法筛选并鉴定重组转化子。结果:1所提质粒p UC19电泳获得预期的3条带,经由标准DNA Markar比对准确,提取浓度满足酶切需要。2酶切质粒p UC19电泳获得预期的1条带,λDNA片段电泳获得的4条带,经由标准DNA Markar比对准确。3培养皿不同区域出现数量不等的蓝色、白色菌斑。结论:应用质粒p UC19可成功构建λDNA片段/p UC19重组质粒。经鉴定,该克隆载体能够导入菌株E.coli DH5α,转化效率较高。     

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA,并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂,提取质粒的全过程只需3~5min就可完成,非常适合于做重组克隆的快速鉴别。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆和启动氯霉素抗性基因表达

黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulosis virus简称AsGv)DNA和pPL603质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后,再用T4连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51感受态细胞。然后在loμg／m1氯霉素的sPBY选择平皿上筛选,得到了抗氯霉素的转化子。经过琼脂糖凝胶电泳检测,转化于中的重组质粒比原载体pPL603质粒分子量大。由于重组质粒上的抗性表达水平可达250μg／m1氯霉素,比pPL603质粒抗性表达水平(5μg／m1)提高50倍。所以重组质粒携带了有启动作用的DNA片段。启动功能片段的分子量,经琼脂糖凝胶电泳测定约为O．9kb。除进行DNA—DNA分子杂交确证外,并用重组质粒pAsGVPl5进行了第二次转化、抗性水平测定和分子量分析。     

一种简单实用的适于大、小质粒的DNA提取方法

以Birabolm和Doly的质粒提取方法为基础,用醋酸铵取代醋酸钠,沉淀染色体DNA和RNA,用异丙醇取代乙醇沉淀质粒DNA,降低了质粒DNA标本中蛋白质和RNA的含量,减少了标本体积。并发现在质粒DNA标本中加入冷异丙醇或冷乙醇后,在-70℃、-20℃、-10℃、4℃和室温下作用,对质粒DNA的回收量无明显影响,在质粒DNA标本中加入冷异丙醇后,在4℃作用0、10、20和30分钟,对质粒DNA的回收量无明显影响。用该方法提取的质粒DNA可直接用于限制性内切酶消化。用该方法提取大肠埃希氏菌     

DNA对电穿孔转染效率的影响研究

以外源红细胞生成素eDNA的表达产物为指标,研究了运载DNA和重组表达质粒的构象对电穿孔转染CHO细胞的效率的影响。结果250μg/ml的运载DNA可使外源基因表达水平提高3倍;线性化质粒DNA比超螺旋DNA更适合于用电穿孔方法获得永久表达。这一结果提示,运载DNA的存在和质粒DNA的线性化对提高电穿孔转染CHO细胞的效率是必需的。     

在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸(Pro)合成途径必须的基因B(ProB)。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ(NPT—Ⅱ),可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—~(32)P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮(acetosyringone)125μg/ml和章鱼碱(octopine)125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草(Nicotana tabacum var.Gexin No.1),叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素(K_m)80μg/ml、6—苄基腺嘌呤(6BA)1μg/ml和头孢氨噻腭钠(Cef)500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。     

狗尾草总DNA的提取与纯化研究

狗尾草杂草中富含多糖和酚类物质,而用已报道的提取方法均难得到高纯度DNA。为此,对提取植物DNA的SDS法进行了改进。用4．5ml细胞提取液,1．0ml饱和NaAc溶液,0．10倍样液体积的无水乙醇,氯仿／异戊醇溶液与样液体积比为0．80,与样液等体积的酚／氯仿／异戊醇溶液(28：21：1)和异丙醇,在65℃水浴加热60min,可从1．0g狗尾草中提取780μg纯DNA。     

一种改进的质粒DNA提纯方法

在重组DNA实验中,获得高纯度的质粒DNA是构建载体所必须的步骤之一。目前,国内外多数实验室沿用氯化铯梯度离心法纯化质粒DNA,本文介绍了一种改进的提取和纯化质粒DNA方法,简便易行。 材料和方法 材料 RNase(Oxioid England),胰蛋白胨(Oxioid England),琼脂糖(Sigma Ⅰ型),BamHI(Bio Lab)。其它试剂均为国产分析纯。所用菌种为E.coli JA221(hsd R.trp E5.Leu