水稻和烟草核酮糖1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶大小亚基之间的分子杂交

利用固定化Ｒｕｂｉｓｃｏ大小亚基解离重组技术,进行水稻和烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ大小亚基之间的分子杂交,实验表明,无论同源或异源的小亚基重组到固定化的大亚基上去后,其羧化酶活性没有明显的变化,但对加氧酶活性却有明显的影响。当水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ的大亚基同烟草小亚基杂交重组后,其加氧酶活性同固定化水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ相比有明显的增高,因而其羧化／氧化比值下降,并且接近于对照的固定化烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ。反之,当烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ的大亚基与水稻小亚基杂交重组后,其加氧酶活性同固定化烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ相比有明显降低,因而其羧化／氧化比值升高,并接近于对照的固定化水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ。由此推测,高等植物Ｒｕｂｉｓｃｏ的小亚基对酶的羧化／氧化比值有一定的影响。     

多酶共固定化的研究进展

固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。过去几十年里,固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来,多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。本文根据国内外研究现状并结合本实验研究从多酶非特异性共价共固定化、非特异性非共价共固定化、非共价包埋固定化以及位点特异性固定化四个方面阐述多酶固定化方法的研究进展,并分析和展望了其在工业上的应用前景。     

尼龙网固定化果胶酶的制备及其性质研究

用尼龙网作载体,经3-二甲氨基丙胺活化,用戊二醛将果胶酶固定化。所得固定化酶Km值与自然酶接近;对温度的稳定性有较大的提高,100℃保温30min才能使其失活。固定化酶在较宽的pH范围内能保持其正常活力,它对金属离子抑制剂的耐受性有较显著的提高,用0.5％果胶溶液作底物,重复使用10次后酶活力保留44％。固定化果胶酶与自然酶相比较,对不同果汁的澄清效果不同。固定化果胶酶在无保护剂存在的条件下,室温放置四个月活力不减少。     

水稻和烟草核酮糖1,5—二磷酸羧化酶／加氧酶大小亚基之间的分子杂交

利用固定化Ｒｕｂｉｓｃｏ大小亚基解离重组技术,进行水稻和烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ大小亚基之间的分子杂交,实验表明,无论同源或异源的小亚基重组到固定化的大亚基上去后,其羧化酶活性没有明显的变化,但对加氧酶活性却有明显的影响。当水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ的大亚基同烟草小亚基杂交重组后,其加氧酶活性同固定化水稻Ｒｕｂｉｓｃｏ相比有明显的增高,因而其羧化／氧化比值下降,并且接近于对照的固定化烟草Ｒｕｂｉｓｃｏ。反之,当     

各种因子对固定化烟草核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶解离作用的影响

pH,温度、离子强度及效应剂等对固定化烟草RuBP羧化酶在2.5mol/L尿素处理下的解离作用有各种不同的影响。在pH6.0时,仅小亚基从大亚基核(L_8)解离,当pH为中性偏碱时,大亚基核也解离。低温和低离子强度均促进酶的解离,而温度和离子强度对大亚基之间的解离的影响显著大于对大、小亚基之间的影响。这表明酶的亚基之间存在着不同的极性和疏水作用,而大亚基之间的疏水作用比大、小亚基之间的强。6-PG对大、小亚基之间解离的抑制作用表明大亚基上的催化位置与小亚基之间有一定的密切关系。     

大孔吸附树脂固定猪胰脂酶的初步研究

目的：为促进脂肪酶在工业上的应用,对以大孔吸附树脂为载体的猪胰脂酶固定进行了研究。方法：以吸附法固定,用单因素法考察了吸附条件对固定的影响。按Eadie—HOfstee法测定了固定化酶及游离酶的表观米氏常数,并具体研究了固定化酶的操作稳定性、热稳定性等性质。结果：固定化酶的比酯交换能力比游离酶上升6倍;最优的吸附条件为：pH7．0,酶加量300mg/g,水分含量20％;吸附时间4h;固定化酶在含水量10％时可稳定操作5批次;同时固定化酶有比游离酶有更好的热稳定性。结论：以大孔吸附树脂为载体对猪胰脂酶进行固定是可行的;与游离酶相比,所得固定化酶有着更高的比酯交换能力和更好的稳定性,更为适用于工业化生产。     

磁性纳米粒子固定化酶技术研究进展

磁性纳米粒子因兼具磁学特性和纳米材料独特性能,被广泛应用于各个领域。就磁性纳米粒子的种类、特性、制备和表面修饰四个方面展开介绍,综述了脂肪酶、漆酶、淀粉酶及其复合酶等生物酶固定化酶技术的最新研究动态,针对磁性纳米粒子在固定化酶技术的研究应用现状进行了总结,以期为磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考。     

锰过氧化物酶的耦合固定化及其性质研究

分别采用海藻酸钠、明胶和壳聚糖为载体,并以戊二醛为交联剂,通过包埋-交联和吸附-交联两种耦合固定化方法制备固定化锰过氧化物酶。探讨了酶的不同固定化条件和固定化酶的部分性能。与游离酶相比,制备的3种固定化酶最适反应pH分别由7.0降低到5.0、5.0和3.0,最适反应温度分别由35℃升高到75℃、55℃和75℃。3种固定化酶的耐热性都显著提高,其中用壳聚糖制成的固定化酶在pH 2.2～11的宽范围内表现出很好的酸碱耐受性。30℃连续测定6～9次酶活力,重复使用的3种固定化酶显示出良好的稳定性。将固定化酶应用在偶氮染料的脱色中,用明胶制成的固定化酶在静置和摇床条件下,以及用海藻酸钠制成的固定化酶在摇床条件下,均表现出与游离酶相近的脱色能力,并且在重复进行的摇床实验中,脱色能力未降低,反应前后的酶活力均没有损失。     

脂肪酶固定化及其稳定性研究

目的:研究脂肪酶的固定化工艺及其稳定性。方法:以四甲氧基硅烷(TMOS)和甲基三甲氧基硅烷(MTMS)为前驱体的溶胶-凝胶法(sol-gel)固定化黑曲霉属脂肪酶。结果:最优固定化条件是:TMOS 0.5mmol、MTMS 2.5mmol,水与硅烷前驱体摩尔比(R)12,PEG400 120μL,给酶量120mg。酶的固定化效率为93.7%,比活力为游离酶的2.2倍。固定化酶和游离酶在60℃处理2h,其残余酶活分别为91.8%和0;在pH 11的缓冲液中处理2h,其残余酶活分别为95.2%和82%。结论:酶经固定化后其活力、热稳定性和pH稳定性均有提高。     

壳聚糖固定化真菌漆酶及其用于处理酚类污染物的研究

Trametessp. AH282在液体培养条件下经邻甲苯胺诱导能有效合成漆酶同工酶A。以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂进行了漆酶A的固定化研究,确定酶固定化适宜条件为：0.1g壳聚糖与15 mL 5%戊二醛交联8 h后,加入30.0U酶固定12h。在此条件下获得的固定化漆酶催化能力为176.4U/g载体,酶活回收率58.5%。与游离酶相比,固定化漆酶与作用底物愈创木酚的亲和力降低,但固定化酶的稳定性有明显改善。固定化漆酶的最适温度为55℃,比游离酶提高5℃;70℃条件下保温8 h,固定化酶保留酶活56.5%,而在相同条件下游离酶酶活明显下降。使用固定化漆酶反应装置进行酚类化合物转化实验,连续进行12批次操作,固定化酶酶活仍保持60%以上,漆酶使用效率明显提高。     

锰过氧化物酶的耦合固定化及其性质研究

分别采用海藻酸钠、明胶和壳聚糖为载体,并以戊二醛为交联剂,通过包埋-交联和吸附-交联两种耦合固定化方法制备固定化锰过氧化物酶。探讨了酶的不同固定化条件和固定化酶的部分性能。与游离酶相比,制备的3种固定化酶最适反应pH分别由7·0降低到5·0、5·0和3·0,最适反应温度分别由35℃升高到75℃、55℃和75℃。3种固定化酶的耐热性都显著提高,其中用壳聚糖制成的固定化酶在pH2·2~11的宽范围内表现出很好的酸碱耐受性。30℃连续测定6~9次酶活力,重复使用的3种固定化酶显示出良好的稳定性。将固定化酶应用在偶氮染料的脱色中,用明胶制成的固定化酶在静置和摇床条件下,以及用海藻酸钠制成的固定化酶在摇床条件下,均表现出与游离酶相近的脱色能力,并且在重复进行的摇床实验中,脱色能力未降低,反应前后的酶活力均没有损失。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中 ,QβRNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶 ,是比较重要的应用酶种之一。该酶由 4个亚基组成 ,其中只有 β亚基是由病毒基因编码 ,而其他 3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时 ,得到的 β亚基几乎都是不溶性蛋白 ,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高 β亚基的溶解性 ,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33 rep ,同时利用pET2 1a( )为表达载体表达其他 3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDS PAGE分析表明 ,当 β亚基与EF Tu Ts亚基共表达时 ,溶解度有一定的提高 ,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度 ,相对增强可溶性 β亚基的表达 ,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高     

利用酵母双杂交筛选豌豆叶绿体镁离子螯合酶D亚基相互作用蛋白

植物叶绿体镁离子螯合酶是四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支(镁分支)的第一个酶,它催化镁离子螯合到原卟啉IX中,形成镁原卟啉IX. 镁离子螯合酶是1个由3个亚基H、D和I组成的多亚基酶,3个亚基均由细胞核编码,进入叶绿体发挥功能.该酶不仅控制着叶绿素的合成,其各个亚基还具有很多其它的功能：H亚基既是ABA受体,又参与叶绿体到细胞核的反向信号传导;D亚基也与叶绿体到细胞核的反向信号传导有关. 本文利用酵母双杂交技术,将编码豌豆镁离子螯合酶D亚基的cDNA片段构建到诱饵载体pGBKT7中,分别用共转化的方法筛选豌豆叶片细胞核编码的均一化cDNA文库和用Mating的方法筛选豌豆叶片叶绿体编码的均一化cDNA文库,共得到121个候选克隆,其中有60个克隆共编码21个叶绿体蛋白质,19个来自于核基因编码,2个来自于叶绿体基因编码. 这些候选蛋白参与叶绿素合成、卡尔文循环、叶绿体蛋白质翻译和叶绿体基因转录等多个代谢过程. 酵母点对点和GST-pull down对其中的4个蛋白做了进一步的验证.这些结果将为D亚基的功能研究提供进一步的线索.     

半夏凝集素的分离纯化和在植物中的分布

从半夏(Pinellia ternata)块根中,经95％硫酸铵沉淀和固定化猪甲状腺球蛋白柱亲和层析分离得到一种凝集素,称为半夏凝集素(PTL)。凝胶过滤、SDS-PAGE和免疫双扩散鉴定PTL是均一的样品,分子量约44kD,由四个约12kD的亚基组成。PTL主要存在于半夏的块茎中,茎中也有少量存在。     

酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响

固定化酶可以提高酶的稳定性,但通常酶通过酶分子上的多个赖氨酸残基随意固定在载体上,这样会使酶的活性显著下降,采用定向固定化酶不仅可以提高酶的稳定性,而且可以保存它的活性。综述了定向固定化酶的几种方法,比较了定向固定化和随意固定化对酶活性的影响。另外,还叙述了酶的活性位点结构变化的自旋共振波谱(EPR)检测。     

半夏凝集素的分离纯化和在植物中的分布

从半夏块根中,经９５％硫酸铵沉淀和固定化猪甲状腺球蛋白柱亲和层板分离得到一种凝集素,称为半夏凝集素。凝胶过滤,ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫双扩散鉴定ＰＴＬ是均一的样品,分子量约４４ｋＤ,由四个约１２ｋＤ的亚基组成。ＰＴＬ主要存在于半夏的块茎中,茎中也有少量存在。     

几种纤维素及无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化

本文就几种纤维素和无机吸附载体对青霉素酰化酶的吸附作用及其固定化进行了研究,结果表明:DEAE-纤维素、EYI-纤维素、微晶纤维素、CM-纤维素、羟基磷灰石、中性氧化铝、硅藻土及粉末状膨润土对青霉素酰化酶都有很强的吸附能力,其固定化青霉素酰化酶的比活分别在1.47～19.43u/g之间,活力回收率为16.3％至84％,几种固定化酶的最适pH均较游离酶低,且其操作稳定性较好。     

生物催化剂用的支持性杂矿石

美国UOP公司的科学家Arena,B.J.及其合作者的研究实验表明,一些固着酶系统是由一些有孔隙的耐熔的无机氧化物构造而成的。按先后顺序把固定化酶系,四卤化钛—一种二胺和一种酶溶液一起配制。据说按这种配制法制备成的固定化酶系使酶的反应活力最大,稳定性亦比较高。     

固定化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶拆分消旋蛋氨酸

基因工程菌BL21/pET22b-argE可高效表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。将含酶细胞包埋于海藻酸钙凝胶中制成固定化细胞酶,用于消旋蛋氨酸的拆分,并将其拆分能力、拆分速度及操作稳定性与游离细胞酶相比较。结果表明:单批次转化固定化细胞酶的拆分能力和游离细胞酶相近,拆分速度较慢;但多批次转化的操作稳定性显著高于游离细胞酶。重复利用8次后的固定化细胞酶仍保有95%以上的酶活力,重复利用5次后的游离细胞酶活已降至20%左右。每克湿菌泥在游离和固定化条件下重复拆分产L-蛋氨酸的量分别为74.16mmol和241.93mmol。酶拆分液中的L-蛋氨酸经重结晶后光学纯度为98.3%。固定化细胞酶比游离细胞酶更具有工业化应用的潜质。     

苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶由四个亚基组成,含两个脱氢丙氨酸残基。植物酶具有内在不稳性,由多种同工酶组成。酶催化过程中发生构象变化,底物经过负碳离子中间体完成反应。该酶并非是二单体负协同变构酶。一级结构表明,酶以无规则卷曲结构为主。酵母基因约2.7kb,有六个内含子,编码75kD_a肽。植物酶由多基因编码,有一个内含子,编码78kD_a肽。启动子部位有两个富含A、C碱基的序列,为胁迫作用基因活化因子结合部位。