水稻矮缩病毒基因组第八号片段的cDNA克隆序列分析及在大肠杆菌中的表达

从水稻矮缩病毒（ＲＤＶ）中国福建分离物中分离出基因组第八号片段ｄｓＲＮＡ,经逆转录合成ｃＤＮＡ,应用聚合酶链式反应技术扩增了编码区ｃＤＮＡ,并克隆在ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）载体上。该片段编码病毒外层外壳蛋白。对重组子进行限制性内切酶分析,亚克隆及全序列测定,结果表明,克隆片段全长１３５６ｂｐ,含有一个１２６６ｂｐ的阅读框架,编码一个含４２１个氨基酸的多肽。与日本流行株相应片段比较,有核苷酸和氨基酸水平     

水稻矮缩病毒基因组第六号片段编码区的cDNA克隆及序列分析

从水稻矮缩病毒中国福建分离物的基因组中分离出第六号片段的双链ＲＮＡ,根据已发表的日本分离物第六号片段ｃＤＮＡ全序列合成了两个寡聚核苷酸引物,经过逆转录合成ｃＤＮＡ,应用ＰＣＲ方法扩增了编码区的基因序列,并将扩增产物克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）载体上。对重组子进行限制性酶切分析和ＤＮＡ序列分析证明,得到的是ＲＤＶ第六号片段完整的编码序列,进而构建了亚克隆并进行了全序列测定。结果表明,我们所扩增和克隆的     

江苏水稻黑条矮缩病毒S10的cDNA克隆序列分析

从来自江苏连云港并在本实验室保存的水稻黑条矮缩病毒接种的病株玉米中提取dsRNA ,采用改进的单引物扩增技术获得了病毒基因组片段S10的cDNA克隆并测定了其全序列。结果表明S10全长 180 1bp ,含有一个ORF ,组织结构与日本报道的RBSDV基本一致 ,核苷酸和推导的氨基酸序列与MRDV的相似性分别为 87.5 %和92 .6 % ,与RBSDV的相似性分别为 93.3%和 96 .4%。该研究也为病毒dsRNA克隆和序列分析奠定了基础     

江苏水稻黑条矮缩病毒S10的cDNA克隆序列分析

从来自江苏连云港并在本实验室保存的水稻黑条矮缩病毒接种的病株玉米中提取dsRNA,采用改进的单引物扩增技术获得了病毒基因组片段S10的cDNA克隆并测定了其全序列.结果表明S10全长1 801bp,含有一个ORF,组织结构与日本报道的RBSDV基本一致,核苷酸和推导的氨基酸序列与MRDV的相似性分别为87.5%和92.6%,与RBSDV的相似性分别为93.3%和96.4%.该研究也为病毒dsRNA克隆和序列分析奠定了基础.     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S7的cDNA克隆及全序列分析

应用RTPCR技术克隆了2个水稻黑条矮缩病毒 (rice blackstreaked dwarf virus,RBSDV)中国分离物,即浙江分离物和河北分离物的基因组片段S7,并测定了他们的全序列。结果表明：RBSDV浙江分离物(RBSDVZj)基因组片段S7全长2193nts(EMBL登录号为AJ297427),RBSDV河北分离物基因组片段S7全长2190nts(EMBL登录号为AJ297428),二者均含有两个开放阅读框(open reading frame,ORF),分别编码约41kD和36kD多肽,2个中国分离物核苷酸同源性高达99%,相应的ORF编码的多肽同源性分别为100%和94.4%,与日本RBSDV基因组片段S7核苷酸同源性为93.4%和93.8%,相应ORF编码的多肽同源性分别为98.1%(ORF1)、96.5%和97.8%(ORF2),与意大利MRDV S6核苷酸同源性为85.1%和85.3%,相应多肽同源性分别为92.3%(ORF1)、85.5%和86.8%(ORF2)。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S9的cDNA克隆和全序列分析

应用RT PCR技术克隆了 3个中国水稻黑条矮缩病毒 (riceblack streakeddwarfvirus,RBSDV)分离株基因组片段S9,并测定了它们的全序列。结果表明 :RBSDV浙江分离株 (RBSDV Zj)基因组片段S9全长 190 0nt(EMBL登录号为AJ2 97430 ) ,RBSDV河北分离株 (RBSDV Heb)基因组片段S9全长 1898nt(EMBL登录号为AJ2 9742 9) ,湖北分离株S9全长 190 0nt(EMBL登录号为AJ2 9170 6 )。 3个分离株S9均含有两个开放阅读框(ORF) ,分别编码约 40kD和 2 4kD的多肽。3个中国分离株之间的核苷酸同源性高达 98.5 %～ 98.8% ,与日本分离株S9的核苷酸同源性均为 89.9%～ 90 .2 % ,而与意大利MRDVS8同源性仅为 85 .3%～ 86 .4%。我们发现ORF2十分保守 ,4个RBSDV分离株S9的ORF2同源性高达为 97.6 %～ 10 0 % ,与意大利MRDVS8的ORF2同源性也高达 94.3%。     

水稻瘤矮病毒基因组S9片段的基因结构特征

应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(RGDV)中国广东信宜分离物(RGDV-C)的基因组S9片段,测定了全序列并进行了生物信息学分析。结果表明,RGDV-C S9片段全长共有1202bp(登录号AY556483),含有一个长的开放阅读框,这一开放阅读框编码一个由323个氨基酸残基组成的多肽,推测分子量约35.6kDa,与泰国分离物(RGDV-T)的全序列相比,它们的核苷酸长度相等,核苷酸同源性为98.1%,氨基酸同源性为98.5%。RGDV S9片段编码的Pns9蛋白在植物呼肠孤病毒属内未发现同源蛋白,其功能尚待确定。利用NCBI的BLAST查找与比较,发现Pns9与伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)ATP依赖的Clp蛋白水解酶组分[ATP-dependent Clp prote-ase proteolytic component(clpP-1)]有21.8%的氨基酸序列同源性。     

水稻瘤矮病毒基因组S9片段的基因结构特征

应用RT-PCR技术克隆了水稻瘤矮病毒(RGDV)中国广东信宜分离物(RGDV-C)的基因组S9片段,测定了全序列并进行了生物信息学分析.结果表明,RGDV-C S9片段全长共有1202bp(登录号AY556483),含有一个长的开放阅读框,这一开放阅读框编码一个由323个氨基酸残基组成的多肽,推测分子量约35.6kDa,与泰国分离物(RGDV-T)的全序列相比,它们的核苷酸长度相等,核苷酸同源性为98.1%,氨基酸同源性为98.5%.RGDV S9片段编码的Pns9蛋白在植物呼肠孤病毒属内未发现同源蛋白,其功能尚待确定.利用NCBI的BLAST查找与比较,发现Pns9与伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)ATP依赖的Clp蛋白水解酶组分[ATP-dependent Clp protease proteolytic component(clpP-1)]有21.8%的氨基酸序列同源性.     

水稻矮缩病毒第10号片段编码区的cDNA克隆及序列分析

采用聚合酶链式反应技术,扩增了水稻矮缩病毒(RDV)基因组第10号片段的编码序列,该片段编码病毒的非结构蛋白。对扩增产物进行了克隆和限制性内切酶分析,并绘制了物理图谱。克隆片段大小为1150 bp,含Sac I、Hind III、Nde I、BamH I、Sai I 等酶切位点,引物设计时还在该片段两侧增加了Bgl II和 EcoR I 切点,以便克隆到植物中间载体质粒。利用上述酶切位点对该片段进行了亚克隆和序列分析,结果表明,本研究克隆的RDV中国流行林基因组第10号片段的编码区与日本流行株的相应区域比较,核酸的同源率为96.03％,编码的氨基酸的同源率为97.17％。     

水稻南方黑条矮缩病毒湖南鼎城株系S10片段的基因组序列分析

运用RT-PCR技术克隆了水稻南方黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)湖南鼎城株系的基因组S10片段(SRBSDV-HuNDCS10),并对其全序列进行了测定和生物信息学分析。结果显示,SRBSDV-HuNDC S10片段全长为1797bp(登录号:JQ337964),含有1个ORF,编码557个氨基酸残基的衣壳蛋白,推测分子量约62.6kD,推测等电点为7.62,与已报道的广东、海南和云南分离物病毒的S10作比较,它们的核苷酸相似性分别为99.7%、99.0%和98.4%,氨基酸相似性分别为100.0%、99.5%和99.3%。对SRBSDV-HuNDCS10及部分Fijiviruses病毒对应片段在5’URT与3’URT存在的保守序列和互补序列进行了归纳,对其ORF编码的氨基酸序列进行了motif查找,得到该属(Fijiviruses)氨基酸序列的10个保守区段。此外,进行了糖基化位点、磷酸化位点及B细胞抗原表位预测,发现了3个可能的N端豆蔻酰基化位点,可能与病毒的侵染机制有关。     

水稻黑条矮缩病毒第九号基因片段的克隆和表达

应用RTPCR技术从表现玉米粗缩病症状的玉米叶片中分离克隆了水稻黑条矮缩病毒(Rice blackstreaked dwarf virus, RBSDV)的第九号片段S9(GenBank登录号 AF540976),并测定了全序列。将该片段的第一个开放读码框(S91)在原核表达载体pET21d中进行了高效表达,表达产物进行N 端氨基酸序列测定,与理论推测的序列完全一致。将表达产物纯化后制备了抗体,经Western blotting从感病玉米叶片中检测到了该蛋白。     

猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT-PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK-15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构。进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cDNA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征。由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础。     

乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.     

水稻黑条矮缩病毒第七号片段的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用RT-PCR技术,根据玉米粗缩病毒S6的末端序列设计引物,从玉米粗缩病感病材料中克隆得到一条2.2kb长的cDNA片段,序列分析表明,该片段全长2193bp,含两个开放阅读框,分别编码41.0kD和36.3kD的多肽。序列分析结果表明,该cDNA片段及其编码产物与水稻黑条矮缩病毒S7的cDNA序列及编码产物存在最高的相似性,推测该cDNA片段为水稻黑条矮缩病毒的S7片段,而不是玉米粗缩病毒的S6。分别将该片段的两个阅读框克隆到原核表达载体pET21d及pGEXKG中,经IPTG诱导后,两种蛋白均得到了高效的表达。表达产物回收后制备并得到了高效价的抗血清。     

水稻瘤矮病毒S12编码第2个RNA沉默抑制子

RNA沉默是一种保守而普遍存在于真核生物体内用于调控基因表达和发育的一种机制,也是植物抵抗病毒侵染和转录的一种防御机制.作为一种反防御机制,许多植物病毒编码沉默抑制子.本研究利用农杆菌共浸润的方法发现,RGDV基因组S12片段编码的Pns12蛋白是该病毒的第2个RNA沉默抑制因子.Pns12能够抑制正义链RNA诱发的局...