猪肾脏羧肽酶性质的进一步研究

(1)猪腎羧肽酶的活力主要集中在細胞內的綫粒体上,对脂溶性的物貭很不稳定,采用一般使酶自綫粒体上脫离的方法,都导致酶的失活。(2)酶含量在腎脏中最丰富,其次是肝,在其他肺、脾、心、脑等組織中并不存在。在所測定的不同动物中酶的分布情况大致相同,但以猪腎中的含量最高。(3)在所测定的底物中最好的作用底物是cbz-甘-L-苯丙,其次是氯乙酰酪氨酸,并分別求得K_M为0.022M和0.2M。(4)酶具有光学(?)构体的专一性,对羧基末端的氨基酸必需是L型;不作用于cbz-L-丙-D-苯丙。cbz-D-丙-L-苯丙虽能水解,但速度約低于cbz-L-丙-L-苯丙的三倍。(5)过量底物有抑制作用,cbz-甘-L-苯丙的最适浓度为0.04M,当浓度增高至0.08M时,活力降低一半左右。此外产物cbz-甘-和类似化合物cbz-L-苯丙有明显的竞爭性抑制作用,K_i分別求得为0.03M和0.0073M。     

青鱼腸胃道中蛋白酶的初步研究

(1)从淡水魚青魚腸胃道中提取出魚蛋白酶,酶制剂活力以酪蛋白作底物約为結晶胰蛋白酶的1/3。酶的前身有酶原存在,激活最适pH为8。(2)酶作用的pH偏于碱,水解酪蛋白和B-精-NH_2的最适pH都为9,酶和酶原对酸都不稳定,当pH低于4吋,酶活性和酶原激活的能力迅速丧失。(3)此酶对热很稳定,反应温度55度时,反应速度仍符合Arrhenius定律。測得水解酪蛋白和B-精-NH_2的活化能分别为14.6千卡/克分子及8.0千卡/克分子,較之胰蛋白酶水解此同一底物所需的活化能为低,尤以后者更显著,約相当于1/2值。(4)对小底物的水解以B-精-NH_2活力最高,K_m=3.3×10~(-3)M(40度pH8.7),为胰蛋白酶水解此同一底物所得K_m值的二分之一,对胰凝乳蛋白酶的底物B-酪-NH_2不作用,而对Cbz-甘-苯丙及白-NH_2却有較明显的活力。(5)半胱氨酸(10~(-3)M)和PCMB(10~(-4)M)对酶活力无影响,但能被DFP和胰蛋白酶抑制剂所抑制。DFP的抑剂随其与酶保温时間的增长而增大。lO~(-4)MDFP与酶液保溫10小时后能抑制酶活力达60%。胰蛋白酶抑制剂对此酶抑制的作用与抑制胰凝乳蛋白酶相类似。(6)从青魚腸胃道中找到有类胰蛋白酶抑制剂的存在。对魚本身蛋白酶有显著的抑制作用,对胰蛋白酶亦能抑制,但抑制能力較弱。     

浙江蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化及其性质的研究

浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶,不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有较弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE纤维素(DE-22,DE-52)和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:Ⅰ与Ⅱ,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶Ⅰ在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带,而组分Ⅱ中还杂有少量组分Ⅰ。激肽释放酶Ⅰ为一糖蛋白,含糖量20.3%,约由221个氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。此酶具有严格的底物专一性,能作用于激肽释放肽的专一底物Z-Phe-Arg-MCA及Bz-Pro-Phe-Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE的14%。以BAEE为底物时,其最适pH为8～9,K_m值为2.85×10~(-4)M。本文测定了不同pH和不同温度下酶的稳定性,pH低于5或大于9,温度在40℃以上,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,慈菇抑制剂与大豆(Kunitz)抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose-4B亲合层析也能提纯激肽释放酶Ⅰ,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光谱测定表明,酶的构象已发生改变。     

猪胰脏羧肽酶转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性研究

羧肽酶(carboxypeptidase)是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,可用作饲料添加剂,促进畜禽生长。猪胰脏中含有一种羧肽酶A1(CPA1),该酶除能水解蛋白质外,还能分解油脂。CPA1在以酪蛋白和橄榄油为底物时,比活力分别为53.14 U/mg和22.4 U/mg;经过p H2.0酸性环境和胰蛋白酶处理后,其酶活残留率分别为95.65%和78.14%。结果表明,CPA1具有转酯功能和耐酸抗蛋白酶特性。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅰ.金属离子与酶活力的关系

(1)大多数金属絡合剂除EDTA和迭氮化鈉外都能抑制酰化酶的活力,在可逆抑制情况下加入不同金属离子能部分或全部恢复酶活力。在固定絡合剂的浓度下酶活力的恢复程度与所加的金属离子浓度有关,每一金属离子都有一最适浓度。从以上結果推测酰化酶中的金属离子可能是Co~( )或Mn~( )离子。(2)在温和的条件下并有底物存在时,邻二氮菲和巯基乙酸对酰化酶的抑制是属于竞爭性,K_i值分別为1.28×10~(-4)M和1.74×10~(-3)M;一分子酶是与二分子抑制剂相結合。推測酰化酶可能是以二聚体形式存在。当抑制剂的浓度增大或使反应温度升高时都将引起不可逆的抑制。若酶与抑制剂預先一起保温亦得到类似的結果。(3)用电透析或在不同pH緩冲液下透析以除去酰化酶中的金属离子,都将导致酶的不可逆失活,因此酶中金属离子除起与底物結合的作用外,尚与維持蛋白貭的构型有关。     

醛縮酶的研究——I.底物对醛縮酶被胰蛋白酶消化时的保护作用

(一)天然醛縮酶受胰蛋白酶消化迅速失活,但底物的存在有明显的保护作用。在实驗的条件下,如有底物的存在,醛縮酶被胰蛋白酶消化20分钟时就釋放出三个肽段(舍27个氨基酸殘基)保留約原活力的60％,而无底物保护的酶則完全失活。 (二)在底物存在下,醛縮酶受胰蛋白酶消化得到的殘余酶蛋白基本上是均一的,具有和天然醛縮酶若干相似的性质。 (三)在底物保护下,醛縮酶受胰蛋白酶消化釋放肽的位置可能在醛縮酶B鏈的N端部分。 (四)底物的可能保护机制是FDP与酶形成相对稳定的酶-底物絡合物,FDP的6-磷酸部分与酶蛋白肽鏈C端酪氨酸或其附近的某个基团相連,二羥丙酮磷酸部分的磷酸則与活性中心賴氨酸附近的氨基酸相結合,使賴氨酸的ε-氨基处于易与底物的酮基結合形成Schiff碱的地位。 (五)磷酸緩冲液也具有对抗胰蛋白酶消化醛縮酶的保护作用,但其机制可能与FDP不同。     

綠豆(Phaseolus aureus)種子蛋白酶的研究

(一)从发芽的綠豆种子中部分提純了一种蛋白酶,活力較粗抽提液提高35倍。此酶水解血紅蛋白的最适PH为4.5,水解苯甲酰精氨酰胺的最适pH在5.2到6.5之間。(二)半胱氨酸(10~(-3)M),碘代乙酰胺(10~(-3)M)和EDTA(10~(-3)M)对酶活力无影响,浓度为10~(-4)M的DFP能抑制酶活力40%。(三)用部分提純的酶制剂水解胰島素B鏈,并用Sanger的DNP-末端技术检查N末端殘基,証明綠豆种子蛋白酶具有比胃蛋白酶,胰凝乳蛋白酶等更广泛的专一性。(四)氫离子浓度对此酶水解苯甲?滨0返挠跋焓粲诰籂幮岳嘈?并求得此酶活性中心可解离基团的pK值为4,2,推測羧基氨基酸是此酶与底物結合时所必需的中心。     

胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的条件优化

采用三因素二次通用旋转设计和体外检测法,对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的条件进行优化。结果表明,底物浓度(X1)、温度(X2)、酶与底物的质量比(X3)对ACE抑制率的影响回归方程为:Y=50.62-2.33X1-1.97X2+5.81 X3-3.36X2X3-6.56X22-1.96X32,胰蛋白酶水解β-乳球蛋白获得ACE抑制肽的最优水解条件为:底物质量浓度为60 g/L,水解温度30℃,酶与底物的质量比为5.5%,水解时间6 h,水解产物对ACE抑制活性最大抑制率为53.86%。     

口服利尿药的研究 Ⅳ.大鼠肾切片对几种口服利尿药的摄聚

前交报告了磺胺类利尿剂的利尿作用与在大鼠体内的代谢特点。本研究系继这个工作之后进行的离体大鼠腎切片的实验,目的在于观察体外腎組織轉运这类化合物的某些特点,及其与化合物利尿作用间的联系。实驗按Cross和Taggart研究兔腎切片摄聚对氨基马尿酸(PAH)的方法进行,用Warburg组織呼吸器温孵,同时观察腎切片耗氧量(Qo_2)。以s/M值(温孵后药物在切片与介液中浓度之比)表示腎切片摄聚药物的能力。测得的s/M值双氫氯噻嗪(HCT)平均为9.34±0.28,PAH为7.17±1.23。二者的s/M值在25℃时均此37℃时的高。其最适pH分別为7.8及8.0。乏氧环境抑制HCT及氯噻嗪(CT)的s/M值;醋酸刺激HCT在腎的积聚;半胱氨酸則无作用。DNP(2.5××10~(-5)M)和氰化钠(50—100×10~(-5)M)均抑制PAH、CT及HCT的s/M值。加入15倍于底物浓度的碘呲啦啥或青霉素亦能抑制HCT的s/M值(此时組織耗氧量不变)。这些結果提示HCT类化合物的腎脏轉运机制与PAH、青霉素及碘呲啦啥等可能相同。此外,还比較了8个磺胺类化合物的s/M值,其中HCT-55(5-氯双氫氯噻嗪)、HCT、HFT(三氟甲基双氫噻嗪)及CT-S(Benzthiazide)等利尿作用較强者,s/M值亦較高。DSA、CT及HCT-18等利尿作用较弱(或没有利尿作用),s/M值亦较低。大鼠肝及腎切片摄聚CT-S的能力相同,但肝切片摄聚HCT的能力远不及腎切片。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D—Ala—PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,Lys或Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~B_(22)-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~B_(22)不是胰岛素活力所必需。但Arg~B_(22)若为D-Arg或Gly代替,活力很低。     

恶臭假单胞菌完整细胞的二氢嘧啶酶的性质

由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)73104产的二氢嘧啶酶对5-苯基海因特异性较高,但也可以水解5-甲硫乙基海因和5-甲基海因;不能水解5-取代基上具有正、负电荷的海因衍生物。酶作用的最适pH因底物不同而有差异,但最适反应温度却相同。 Ag+、Cu2+和Zn2+及金属离子螯合剂对酶活力有强烈抑制作用。将细胞用EDTA处理后约有70％酶活力损失,再加入金属离子,只有Fe2+能将酶活力恢复到原来活力的90％以上,其它金属离子无此作用,证明Fe2+是酶反应所必需的。静息细胞和新鲜细胞在弱酸或弱碱条件下,于40℃以下保温均可使细胞酶活力提高2—3倍,且保温的菌悬液的离心上清液几乎无酶活力;而无细胞提取液保温后无酶活力提高现象,说明在上述条件下,保温可改善细胞膜对底物的通透性,提高酶作用效率。氧能抑制酶反应,主要是因为氧与底物形成可逆结合复合物所致。游离细胞的二氢嘧啶酶对5-苯基海因、5-甲硫乙基海因和5-甲基海因的Km值分别为1.61×10-2、2.08×10-2和1.61×10-2M。     

醛缩酶的活性中心

醛縮酶經羧肽酶消化催化底物果糖-1,6-二磷酸分解的活力下降至7%以后,竞爭性抑制物果糖-6-磷酸对酶不再有抑制作用,說明被羧肽酶消化切除的C末端酪氨酸和酶与竞爭性抑制物的結合有关。此外还发现底物果糖-1,6-二磷酸能保护醛縮酶不受羧肽酶消化。因此我們认为C末端酪氨酸是醛縮酶的活性中心。酶分子通过它和竞爭性抑制物果糖-6-磷酸及底物果糖-1,6-二磷酸的-6-磷酸部分結合。利用邹承魯新近提出的方法推算,醛縮酶的三个酪氨酸末端中有二酪氨酸是酶的活性中心。     

胰岛素B链中肽段的合成 Ⅰ.苄氧羰甘·苯丙·苯丙·酪·苏·脯·N~6-对甲苯磺酰赖·丙氨酸甲酯的合成

胰岛素B链中C端八肽的衍生物,即Cbz·gly·phe·phe.tyr·thr·pro·(ε-Tos)lys·ala·OCH_(30)曾依(5 3)方案用DCCI法和叠氮法分别合成。其中五肽片段的衍生物也采用不同途径,即DCCI法、活化酯法和叠氮法,C端三肽的衍生物也采用前二法均合成得到相应的均一的产品。N~∈-对甲苯磺酰-八肽及其中间体,Cbz·gly·phe·phe·tyr·thr·OH和H·pro·(∈-Tos)lys·ala·OH分别用羧肽酶、肾羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和氨肽酶水解,证明了各个肽段内并无个别可测得的消旋氢基酸存在;而羧肽酶和胰凝乳蛋白酶作用于这些肽段时所水解的肽键的位置,和这些酶水解胰岛素B链本身的结果相符合。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1) 浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2) 提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3) 类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_m为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4) 类凝血酶能被DFP及PMSF所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶的研究——Ⅰ.分离提纯及理化、酶学性质的鉴定

(1)浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有精氨酸酯酶活力的组分。它们分别是激肽释放酶、类凝血酶及类溶血纤维酶。其中类凝血酶的精氨酸酯酶活力最高,约占总酯酶活力的60%。(2)提纯后的类凝血酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带。经凝胶过滤及SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量约43,000。氨基酸组成分析表明含有较多的酸性氨基酸及脯氨酸,此外还含有约6%的中性糖,9%的己糖胺及3.3%的唾液酸。(3)类凝血酶能直接使血纤维蛋白原凝聚,水解BAEE 的活力约是胰蛋白酶的2.7倍,K_(?)为3.4×10~(-4)M,高于其它已知的蝮亚科蛇毒类凝血酶活力。它不作用于BANA、BAPA 及其它蛋白底物。蛇毒类凝血酶与人凝血酶一样,对专一萤光底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA 都有明显活力,但其凝结血纤维蛋白原的活力却远低于人凝血酶。(4)类凝血酶能被DFP 及PMSF 所抑制,但抑制速度缓慢,不能被胰蛋白酶的专一抑制剂TLCK 所抑制,因而是专一性很强的丝氨酸蛋白酶。     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯OMe—(DNIOH)。OMe—DNIOH的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D-Ala-PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,BOG—Lys或OTB—Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~(B_(22))-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~(B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~(B_(22))不是胰岛素活力所必需。但Arg~(B_(22))若为D-Arg或Giy代替,活力很低。     

核酸类化合物对C~(14)—甘氨酸参入大腸杆菌原生质体制剂的影响

用Lissapol处理的大腸杆菌原生貭体的制剂具有C~(14)-甘氨酸的参入活性,RNA有提高参入的能力,但不稳定;碱水解的RNA則有更显著的作用。四种2′,3′-核苷酸对甘氨酸参入都有刺激,一般以尿嘧啶核苷酸的效应为高,核苷的刺激作用較核苷酸为差,核糖无影响,碱基稍有抑制,用羧肽酶水解及2,4-二硝基氟苯处理标記的蛋白貭,証明C~(14)-甘氨酸参入到蛋白貭的肽鏈中。     

日本血吸虫酚酶的研究

日本血吸虫成虫取自人工感染的豚鼠,磨成匀浆后用Warburg呼吸仪測定其酚酶活力。在pH6.8时,对所試4种酚类均有显著的氧化作用,耗氧量以对甲酚为最強,其次为3,4-二羟苯丙氨酸和酪氨酸,邻苯二酚最弱。酶作用后反应液呈灰黑色(3,4-二徑苯丙氨酸,酪氨酸)或赭紅色(对甲酚,邻苯二酚),氧耗越強,色泽越深。以酪氨酸作为底物在pH8.0,最后浓度为4mM时酶活力已接近最高峯;在所試的pH范围(6.5—8.8)內,酶活力随着pH的上升而增高,在pH 8.0—8.8时活力无大差別。肝片吸虫中亦存在着酚酶,但对上述四种底物的相对活力与血吸虫不同,对邻苯二酚和对甲酚的活力远較3,4-二羟苯丙氨酸和酪氨酸为高。血吸虫的酚酶仅存在于雌虫中,雄虫匀浆无此酶作用。治疗血吸虫病的有效药物酒石酸銻鉀对血吸虫的酚酶有显著的抑制作用,最后浓度为10~(-4)M时,酶活力被抑制約60%。以20毫克/公斤体重的酒石酸銻鉀注射感染血吸虫的豚鼠,1小时后解剖取得血吸虫,其酚酶活力較不注射对照低40—70%。由于酚酶在吸虫产卵功能中的重要性,这种抑制作用亦可部分地解释酒石酸銻鉀的作用机制。     

5,5′-联硫-2,2′-双硝基苯甲酸及其有关化合物对乙酰胆碱酯酶的别构效应

5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸(DTNB)及其有关化合物TNB、TNB-Tch都是黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的别构效应剂: 1.TNB非竞争性地抑制、而DTNB则激活该酶水解乙酰硫代胆碱和丁酰硫代胆碱的活力。对水解乙酰胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆无影响。2.TNB-Tch比TNB具有更强的抑制作用。且对该酶水解乙酰胆碱、乙酰硫代胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆有抑制作用。抑制类型与作用底物有关。底物在外周的结合能解除其抑制。3.钙离子可以解除TNB和TNB-Tch的抑制作用,而箭毒亦能与之对抗。对蛇毒乙酰胆碱酯酶,除了极低浓度(<10μM)DTNB和TNB有微弱的抑制作用外,TNB-Tch以及较高浓度的DTNB和TNB都具有强烈的激活作用。而对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的活力皆无影响。