小克银汉霉核糖体DNA PCR扩增产物的限制性片段长度多型性(英文)

应用一对寡核苷酸引物ITS1与ITS4对核DNAG＋C百分数小于30％的小克银汉霉（Cunninghamella）属的核糖体DNA（rDNA）内转录间区（YTS）进行了扩增。测试的属于10个种和变种的22株菌都得到了扩增产物。在同属不同种之间扩增的ITS片段长度有巨大差别。据此可分为三组。这三组所含分类群数及其DNA长度分别为;第一组4种1变种,小于764碱基对（bp）;第二组2种,765～824bp;第三组2种1变种,大于825bp。所研究的许多种中,特别是第三组,单凭其PCR产物的长度就能区分开来。但在第一、二组就需借助限制性内切酶的分析才能予以区分。我们选用了RsaI,TaqI;Tru9I,和HinfI4种限制性内切酶,对所有扩增产物进行了限制性片段长度多型性（RFLPs）的分析。在雅致小克银汉霉（Celegans）、巴西玉蕊小克银汉霉（Cbertholletiae）、和布拉氏霉（Cblakesleeana）各种的限制性酶切图谱,种内非常一致而种与种之间有差别。反之,在某些种其限制性酶切图谱不仅种间互不相同,在种内不同株之间也出现1～3种酶切图型的差异。在这种情况下,只能综合各种资料才能将它们区分开来。本研究肯定了PCR－RFLP在区分小克银汉霉种和变种上的意义,并发现种内个体的差异。这在我们后来所进行的序列分析研究中得到了进一步的证实。     

刺孢小克银汉霉原变种和轮生刺孢小克银汉霉变种(新组合)

刺孢小克银汉霉[Cunninghamella echinulata(Thaxt.) Thaxt. ex Blakeslce]是小克银汉霉属的模式种,多年来因不同作者是否将贝尼尔小克银汉霉(C. bainieri Naum.)包含在内而对此种持广义(sensu lato)或狭义(scnsu stricto)的不同理解。我们在国内分离到51株刺孢小克银汉霉(广义)菌种,经与获自css的7株菌(包括刺孢小克银汉霉的模式菌种在内)和IMI的1株菌(原定名称均为刺孢小克银汉霉)一起研究后,根据它们的无性型形态特征有明显不同但在配合试验中又可互相配合形成可育的接合孢子的结果,认为将它们处理为同一个种的两个不同变种较为合理.其中,13株中国的菌和3株CBS及IMI的菌被鉴定为刺孢小克银汉霉原变种(C. echinulata var. echinulata);其余的38株中国的菌和5株CBS的菌被鉴定为轮生刺孢小克银汉霉变种(新组合)[C. echinulata var. verticillata (F. S. Paine.) comb. nov.j.以‘轮生(verticillata)’作为新组合变种的加词是根据与贝尼尔小克银汉霉同物异名的‘轮生布拉小克银汉霉(C. blakesleeana var. verticillata (F. S. Paine) Baijal & B. S. Mchrotra)’而来的.在前人的工作中,对刺孢小克银汉霉持狭义理解的作者往往根据孢子枝的分枝方式、巨型暗色孢子的有无、以及40℃能否生长来区分这两个分类群.对刺孢小克银汉霉持广义理解的作者则认为这些特性毫无意义.我们同意后面两个特性意义不大,因为二者的许多菌系都能形成巨型暗色袍子并在40℃生长,但认为孢子枝分枝方式确实是区别这两个分类群的重要依据.此外,根据产孢构造的种类、孢子枝主枝的直径、孢子枝第一次分枝的数目、分枝长度、孢子枝主枝的顶生泡囊形状以及其直径等性状综合考虑,这两个分类群是不难明确区分的,对12株刺孢小克银汉霉原变种和13株轮生刺孢小克银汉霉相互之间所进行的配合试验结果表明,在具一定性亲和力的(+)、(一)菌系同时存在时,两个变种内和变种之间均可形成可育的接合孢子。对上述三种配合的各六对菌所形成的有性型形态的研究结果则表明,除轮生刺孢小克银汉霉变种内形成的接合孢子的壁往往较厚外,各种配合形成的有性型形态基本上是一致的.我们研究组的其他成员最近曾对小克银汉霉的22株菌进行了rDNA的ITS区的PCR产物长度测定,其中包括了刺孢小克银汉霉原变种和轮生刺孢小克银汉霉变种的各3株菌,它们的平均长度(bp)分别为890±7.5和915±7.6.这个结果也支持了我们在这两个分类群可以互相配合的情况下仍将它们作为两个不同变种的处理.这两个分类群虽然已被发表多次,但它们的描述和绘图均过于简单而未能充分显示出它们的区别性特征,因此我们在本文中再次作了描述并再次提供了详尽的线条图和显微照相.     

小克银汉霉核糖体DNAPCR扩增产物的限制性片段长度多型性

应用一对寡苷酸引物ＩＴＳ１与ＩＴＳ４对核ＤＮＡＧ＋Ｃ百分数小于３０％的小克银汉霉属的核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）内转录间区（ＩＴＳ）进行了扩增。测试的属于１０个种和变种的２２株菌都得到了扩增产物，在同属不同种之间扩增的ＩＴＳ片段长度有巨大差别。据此可分为三组。这三组所含分类群数及其ＤＮＡ长度 ：第一组４种１变种，小于７６４碱基对；第二组２种，７６５－８２４ｂｐ；第三组２种１变种，大于８２５ｂｐ。所研究     

一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

水稻二化螟和三化螟基因组ddRADseq文库的构建

本文介绍了构建水稻二化螟和三化螟"双酶切限制性酶切位点关联DNA测序"(Double digest restrictionsite associated DNA sequencing,ddRADseq)文库的方法。利用安捷伦2100生物分析仪对4种单酶切及2种双酶切的酶切产物片段大小及分布范围进行分析,筛选出Mlu C I和Nla III两种限制性内切酶组合对螟虫基因组DNA进行酶切。酶切后的DNA片段两端连接上特定的P1、P2接头后,用Pippin Prep回收大小为285-435 bp的DNA片段。通过PCR扩增进行文库的富集并引入index序列。构建好的ddRADseq文库用琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪进行质量检测。本方法所构建的文库DNA片段长度、分布和摩尔浓度能够达到Illumina平台测序的技术要求。本研究证实了利用Mlu C I和Nla III组合酶切构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库的可行性,为在水稻螟虫中利用ddRADseq技术开展生物地理学、种群遗传学和系统发育重建等方面的研究奠定基础。     

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物16S rDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA(amplified ribosomal DNA restrictionanalysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属3种植物和沙棘属1种植物根瘤内Frankia DNA,得到一长约1500bp的扩增产物.选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切,得到稳定的酶切图谱.将所测8个感染赤杨的Frankia样本区分为3个不同的组,所测3个感染沙棘的Frankia样本区分为3个不同的组.显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性.     

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢,采用PCR-RFLP技术,对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列,发现1处单核苷酸多态性位点,可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增,用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切,并用1.5%的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示,斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段,分别为315 bp和875 bp,乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。     

反向PCR方法克隆腾冲嗜酸两面菌的分子伴侣基因*

根据已知的Sulfolobus属的分子伴侣基因,设计简并引物,用PCR的方法从腾冲嗜酸两面菌(Acidianus tengchongensis)基因组DNA中分别克隆到了分子伴侣α亚基和β亚基的约500bp的基因片段。以它们为探针进行Southern杂交,确定了合适的限制性内切酶。以确定的限制性内切酶消化的基因组DNA环化物为模板,进行反向PCR反应,引物的延伸方向由已知序列出发沿环化分子向未知区域进行,扩增产物经测序表明为α亚基和β亚基基因。根据所得序列分别设计两对引物进行PCR,测序结果     

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物16SrDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA（amplified ribosomal DNA restriction analysis）法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属3种植物和沙棘属1种植物根瘤内FrankiaDNA,得到一长约1500bp的扩增产物,选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切,得到稳定的酶切图谱,将所测48个感染赤杨的Frankia样本区分为3个不同的组,所测43个感染沙棘的Frankia样本区分为3个不同的组,显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性。     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

胆型螺旋杆菌（Helicobacter bilis）的分离、鉴定与序列分析

鉴定分离到的微需氧菌为螺旋杆菌,并对该菌进行分型。小鼠皮下或肌肉注射地塞米松使其免疫抑制,取小鼠肠内容物培养,对分离到的细菌,经油镜、电镜观察。然后提取细菌DNA,用根据螺旋杆菌（Helicobacter sp．）rRNA保守区设计的引物P7/P8进行扩增,并对扩增产物分别用MboI、HhaI、XspI内切酶酶切,酶切产物用10%PAGE分析。再用根据螺旋杆菌胆型（H. bilis）rRNA设计特异引物P7/Pb扩增,将扩增产物测序分析。最后,将该细菌在Scid小鼠上作动物感染。细菌在油镜下呈鸟翼状,电镜下观察到双极鞭毛,无周质纤毛。引物P7/P8扩增出374bp的特异带,此片段能分别被MboI、HhaI、Xsp内切酶酶切。引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI、HhaI、XspI的内切位点,与文献中H.bilis序列比较,同源性为97.5%。动物感染试验符合Koch准则。分离到的细菌确为胆型螺旋杆菌。     

基于PCR-RFLP技术鉴定常见食源性致病菌

根据细菌核糖体基因16S rRNA保守端400 bp大小区段特征设计引物,应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立一种新型灵敏的食源性致病菌鉴定技术。首先用特异性引物对9属19种细菌基因进行PCR扩增,扩增产物应用7种限制性内切酶Eco52Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ进行消化酶切,再利用琼脂糖凝胶电泳分辨酶切DNA片段大小数目,分析不同种属细菌酶切产物态型,从而进行基因型鉴别,针对16S rRNA基因片段利用RFLP进行分析,结果表明:19种致病菌表现出10种特异性的RFLP图谱,可准确鉴定区分9属细菌,最低检测限可以达到1 pg/μL。这证明PCR-RFLP技术可用于常见食源性致病菌的快速鉴定。     

阴道分离因肯毛孢子菌的分子鉴定和种内分型

分别采用rRNA基因内转录间隔区(ITS)和基因间隔区(IGS1)测序,ITS和IGS1区PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和基因组DNA的随机扩增多态性DNA(RAPD)等方法,对三株因肯毛孢子菌Trichosporon inkin进行分子特征及种内分型研究。结果显示,不同菌株的rRNA基因ITS区和IGS1区的序列相似性均高达100%,RFLP酶切图谱具有较理想的种内一致性,而不同菌株的RAPD图谱不尽相同。研究表明:rRNA基因IGS1区测序及RFLP酶切可考虑用于因肯毛孢子菌的菌种分子鉴定,而基因组DNA的RAPD则较适合于菌种的种内分型。     

一种简便、通用的PCR产物克隆系统

目前应用PCR技术扩增目的基因进而得到克隆化基因的方法已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。尽管在引物两端引入限制性内切酶识别位点定向高效地克隆目的基因这一设计思路极富魅力,但在实践这个思路的过程中经常遇到困难,其主要原因是由于当多种限制性内切酶的识别序列位于DNA片段的两端时,其酶切效率变得很低。这是因为限制性内切酶的切割效率同其识别位点两侧DNA的长度有很     

藏羊肖氏隐孢子虫的分离鉴定

为了解隐孢子虫在藏羊中的感染情况,采用饱和蔗糖漂浮法检查34份藏羊新鲜粪便。通过巢式PCR扩增阳性分离株的18S rRNA、HSP70和CpA135位点基因,并采用限制性内切酶Ssp I和Vsp I对18S rRNA产物进行酶切分析。同时构建系统发育树,分析藏羊感染隐孢子虫类别。结果显示仅1只藏羊感染隐孢子虫,18S rRNA与Cryptosporidium xiaoi山羊分离株(GU553016)相似率为99.9%;HSP70与C.xiaoi绵羊分离株(FJ896041)相似率为98.7%;CpA135与C.ubiquitum人源分离株(HM358023)相似率为99.3%。18S rRNA产物经Ssp I酶切后获得3条条带493 bp、262 bp和103 bp,经Vsp I酶切后获得3条条带508 bp、181 bp和104 bp,与C.bovis酶切条带相似。基于18S rRNA和HSP70的系统发育分析显示,该分离株与C.xiaoi亲缘性最近。这是首次在藏羊体内发现肖氏隐孢子虫。     

中国常见仓储书虱PCR-RFLP快速识别

应用PCR-RFLP技术,对我国4种常见仓储书虱即嗜虫书虱Liposcelis entomophila(Enderlein)、嗜卷书虱L.bostrychophila(Badonnel)、无色书虱L.decolor(Pearman)和小眼书虱L.paeta(Pearman)开展快速识别方法的研究。采用CTAB法从上述4种书虱体内提取基因组DNA,选用1对引物扩增16S rDNA基因区域,分别用5种限制性内切酶对PCR产物进行酶切。结果表明,PCR扩增片段大小约为500bp,用限制性内切酶DraI酶切得到的片段可将供试书虱区分开。该方法不受4种供试书虱地理种群、虫态(成虫、若虫)和性别的影响,可用于4种书虱的快速识别。     

利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6 0基因     

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物. 针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤：首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端) 酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.     

用分子生物学技术对草菇进行菌株鉴别

利用AP-PCR和RAPD技术对三个草菇菌株进行鉴别,其结果与用草菇菌株V34基因文库中的中等重复序列为探针进行限制性内切酶长度多态性分析(RFLP),及对编码核糖体5.8SrRNA的DNA(rDNA)进行PCR扩增后的产物进行限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)的结果相一致。这一结果显示出用这四种方法对草菇菌株进行鉴别具有相似的效果。同时用这四种方法构建的分子生物学标记显示出这三个菌株中的两个菌株在遗传上有着较大程度的相似性。