均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

广西甜茶ISSR-PCR反应条件的建立与优化

为了探讨广西甜茶ISSR实验中的多种因素对实验结果的影响,采用单因素法对PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+, dNTP,引物, Taq酶和模板DNA)在5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度和循环次数。结果表明：25滋L的最佳反应体系为,1×PCR Buffer、MgCl22.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物0.8滋mol/L、Taq DNA聚合酶0.75 U、模板DNA 80 ng;最佳反应程序为：在94℃下进行3 min预变性;随后循环扩增35次(包括94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min);最后在72℃下延伸10 min。本研究建立的广西甜茶的最佳ISSR-PCR反应条件为进一步进行遗传多样性研究奠定了基础。     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

DNA分析与扩增

930026大于1 0kb的DNA片段的离体扩增[英";/Kainz,P.…,Ana|.Bioehem.-1992,202(1).一46～49C译自DBA,1992,11(13),92~07224] 从九噬菌体模板合成10.9kb DNA片段,以扩大PCR范围。采用已发表的引物序列和条件时,应用AmpIiTaq和1人J,l三的Taq DNA聚合酶进行扩增的结果不他,ifli应用TLlb DNA聚合酶根本不能扩增这一片段。因此,采用Tub酶和二步PCR扩增方法(65℃进行退火和延伸,然后在9CC变性1.5分钟),获得了可靠的结果。酶浓度降到0.4U/50芦l,延伸时间减到4～12分钟(最优为8分钟)时,目标片段可被特异地扩增。若延长到20分钟以上,…     

一种高特异性的改良降落PCR

为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验。自盐藻Dunaliella bardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝眩素生物合成相关基因（cbr）上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD-PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD-PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带。无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

降落-重叠PCR法四重融合构建平菇同源重组片段

对多个长片段的基因融合目前仍缺少有效的方法. 本文提出一种新的融合PCR策略,即在常规的重叠PCR的第1步和第2步均增加1个降落PCR程序,减少不适当的退火温度和PCR产物3′端额外碱基A对片段融合、扩增的影响,提高正确融合与扩增的效率. 结果表明,为构建平菇葡聚糖合成酶启动子的同源重组序列,在4个长度分别是1 015 bp、2 822 bp、2 206 bp和1 008 bp的片段进行融合时,在重叠PCR的第1步加上退火温度61.5 ℃～57.5 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序,在重叠PCR的第2步加上退火温度60 ℃～56 ℃、每降落0.5 ℃进行1个循环的降落PCR程序,经过1次PCR即获得顺序正确的全长融合片段. 测序结果与4个片段序列的一致性达到98.5%,降落-重叠PCR法对多个长片段的基因 融合具有较高的应用价值.     

利用PCR技术鉴定河豚鱼的探索

目的:利用聚合酶链反应(PCR)技术,建立鱼类制品中河豚鱼成分的分子生物学鉴定方法,弥补河豚鱼形态学鉴定的缺陷。方法:通过阅读文献,确定河豚鱼鉴定的靶基因并筛选特异性引物,提取河豚鱼DNA,优化PCR反应条件,扩增河豚鱼特异性DNA片段,并通过DNA电泳显示特异性扩增的DNA条带。结果:选择细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)作为河豚鱼成分鉴定的靶基因,PCR最佳反应条件是退火温度68℃,镁离子浓度2.0 mmol/L,DNA模板加入量0.07～0.1μg。河豚鱼特异性引物具有较好的特异性,与市场上常见的鲤鱼、草鱼等水产品无交叉反应。结论:所建立的PCR方法可以有效鉴定鱼类制品中河豚鱼成分。     

基于XcmI识别序列的T载体的构建及连接PCR片段的优化

目的:构建基于Xcm I识别序列的T载体并对与其连接的PCR片段进行优化。方法:首先将5’和3’端含有Xcm I识别序列的人组蛋白H4 c DNA定向克隆至p CDNA3.0表达载体中,再用Xcm I酶切得到基于p CDNA3.0载体骨架的T载体,为提高T载体与DNA片段的连接效率,在DNA片段PCR扩增前将其引物进行磷酸化并在PCR结束后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理,分别将长度为312 bp和1 329 bp的PCR片段T载体连接并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,培养转化子,通过菌液PCR和琼脂糖凝胶电泳估算转化子的阳性率。结果:经Xcm I酶切后的T载体能高效地与目的 DNA片段连接;除T载体本身质量外,扩增DNA片段所用引物的磷酸化与否也是影响克隆效率的重要因素之一;对较大的插入片段而言,经PCR扩增、纯化后再用Taq DNA聚合酶和d ATP处理也能够显著增加连接效率。结论:克服了对蓝白筛选或插入自杀基因等实验条件的限制,可为T载体的常规制备并与目的片段进行高效地连接提供了新的线索。     

散斑壳属ISSR-PCR反应条件的优化

以散斑壳属 (Lophodermium) T29、T50、T62、R111菌株为研究材料,对该属ISSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及退火温度等条件进行优化,寻找出适合此类真菌ISSR-PCR反应的最佳反应体系为15 μL反应体系中,模板DNA浓度为 4～8 ng/μL、引物浓度 0.4～0.5 μmol/L、Mg2 浓度 2.0～2.5 mmol/L、dNTPs浓度 0.15～0.30 mmol/L、Taq DNA聚合酶量1.5～2.5 U,退火温度为 52 ℃.     

RAPD 技术在药用植物绞股蓝鉴别中的初步研究

运用RAPD技术对绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究.采用改进的CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓(Cayratia japonica)3种植物的总DNA,主要以七叶绞股蓝DNA为模板,采用随机引物WGS001进行PCR扩增,对反应体系包括模板、Mg2 、Taq酶、牛血清白蛋白(BSA)、退火温度进行优化.优化的反应体系总体积25 μL ,含MgCl2 2 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物 0.4 μmol/L、模板60 ng、Taq 酶1 U、BSA 2 μg/μL,退火温度58℃.用10条含20个碱基的随机引物对以上3种植物总DNA作PCR扩增,进行引物筛选.筛选得到的两条随机引物(WGS001、WGS004)可扩增得到识别这些物种基因组DNA的多态性片段.这些片段可以有效地鉴别绞股蓝和乌蔹莓.