转基因植物中标记基因的剔除

在目前的植物转化系统中,要求在关注基因或目的基因转入细胞时,同时有标记基因存在.标记基因主要是抗生素或除草剂的抗性基因.借标记基因的表达可以将转化细胞从大量的未转化细胞中筛选出来,但标记基因的继续存在,特别是在转基因食品中,是人们广泛关注的问题.培育无标记基因的转基因植株已成为植物生物工程研究中的新课题.该文介绍了剔除标记基因的两种方法:分离剔除和重组剔除,并对近年来这两种方法在培育无标记基因的转基因植物中的应用和进展作了介绍.     

转基因植物中标记基因研究概况

标记基因在植物基因工程中具有重要的作用。它在遗传转化中的关键作用是区分转化和非转化的细胞,以筛选并鉴定出转化的细胞、组织和转基因植株。目前,已报道的标记基因种类很多,划分标准也各不相同。出于对生态环境和转基因食品的生物安全性考虑,从传统的选择标记基因、与激素代谢相关的基因、与氨基酸代谢相关的基因、与糖类代谢相关的基因、能解除化合物毒性（或胁迫）的基因、编码能产生特定荧光物质的蛋白酶类的基因、利用颜色差异性筛选转化体的相关基因及抗性标记基因的敲除技术八个不同的方面,综述了标记基因的种类、作用原理、应用价值及存在的问题。在标记基因的综合应用方面,详细总结了标记基因与组织（或器官）特异性启动子和MAT载体系统的结合应用,以及P．葡萄糖苷酸酶作为多功能标记基因的综合应用。最后,对标记基因的发展前景进行了探讨分析。     

转基因植物中标记基因研究概况

标记基因在植物基因工程中具有重要的作用。它在遗传转化中的关键作用是区分转化和非转化的细胞, 以筛选并鉴定出转化的细胞、组织和转基因植株。目前, 已报道的标记基因种类很多, 划分标准也各不相同。出于对生态环境和转基因食品的生物安全性考虑, 从传统的选择标记基因、与激素代谢相关的基因、与氨基酸代谢相关的基因、与糖类代谢相关的基因、能解除化合物毒性(或胁迫)的基因、编码能产生特定荧光物质的蛋白酶类的基因、利用颜色差异性筛选转化体的相关基因及抗性标记基因的敲除技术八个不同的方面, 综述了标记基因的种类、作用原理、应用价值及存在的问题。在标记基因的综合应用方面, 详细总结了标记基因与组织(或器官)特异性启动子和MAT载体系统的结合应用, 以及b-葡萄糖苷酸酶作为多功能标记基因的综合应用。最后, 对标记基因的发展前景进行了探讨分析。     

植物转化中的安全标记基因

转基因植物中的除草剂或抗生素抗性标记基因的生态环境和食用安全性一直颇有争议.糖类分解代谢酶基因作为安全标记基因,近年来在植物转化中显示了巨大应用潜力.这类标记基因编码产物是筛选剂糖类的分解代谢酶,使转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源从而获得优势生长,非转化细胞则因饥饿生长被抑制但不被杀死,故称为正筛选系统(positive selection system).目前木糖异构酶基因（xylose isomerase,xylA）和磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,pmi)等安全标记基因已成功应用于植物转化.     

绿荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用

绿荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）是源于水母（Ｊｅｌｙｆｉｓｈ）、海笔（ＳｅａＰｅｎ,ＳｅａＰａｎｓｙ）等海洋无脊椎动物的一种蛋白质,这种蛋白质在体外经适当波长的光激发便可发出绿光,所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器（ＦＡＣＳ）均可检测到。ＧＦＰ作为动、植物以及微生物基因工程研究上的一种选择标记具有检测灵敏度高,操作简便,对机体毒副作用小且不需要添加任何底物或辅助因子等优点,更重要的是检测ＧＦＰ无损于细胞或胚胎的完整性及活力。本文概括介绍ＧＦＰ的生化、发光光谱及遗传学特征及其在转基因动物研究上的应用。     

无标记(Marker-Free):转基因植物研究的新趋势

目前,几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子.为了消除由此而引起的公众的安全性顾虑,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生.无选择标记的转基因植物具有许多独特的优势,如消除大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧及可以反复地向已转化的植物中叠加外源基因等,因此,这种新策略(无标记)有着巨大的应用潜力.本文对获得无标记转基因植物的一些途径做一综述.     

植物遗传工程

921080转化植物细胞的物理方法仁英」/Oard,J.H。jB ioteehnol.Ady一1991,9(i)一i~12〔译自DBA,1991,10(15),91一08688」 综述了植物细胞转化的物理方法,包括微注射;粒子枪(微弹射)法;放电粒子加速法和其它转化法(如花粉管途径、针头注射分孽、超声波、气枪粒子轰击法、DNA的隋性浸溃和激光法)。用粒子加速或微注射技术已使外源基因在转基因植株及比子代中转化并表达。一可用细胞映养物或胚状 体作导人选择性标记(如乙酞乳酸合酶、氯霉素乙 酞转移酶、声一葡糖若酸酶等G种)基因的靶子, 这些基因在核或叶绿体中稳定表达。以将玉米(Zoa …     

转基因植物中的标记基因

概述并评价了转基因植物研究中所采用的标记基因,利用它们都无法实时、无伤地筛选出转化细胞,但新近用作标记基因的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）,与流式细胞仪（ＦＡＣＳ）联用,便弥补了上述标记基因的不足。     

灰葡萄孢菌过氧化物酶体及细胞核的荧光蛋白标记

【目的】对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的细胞核和过氧化物酶体进行荧光蛋白标记,为研究其生长发育和侵染过程中细胞结构和细胞器动态提供基础。【方法】以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DsRED、mCherry)为报告基因,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,AtMT)将3种荧光蛋白标记载体分别导入灰葡萄孢菌标准菌株B05.10;通过PCR检测及荧光观察筛选和验证转化子,并进行单孢纯化;利用共聚焦显微镜记录细胞器荧光定位情况。【结果】获得了过氧化物酶体或细胞核稳定表达红、绿色荧光的重组单孢菌株,PCR验证表明标记基因成功整合入转化子基因组。在标记细胞核的菌株中,菌丝和孢子中可见多个明亮、圆形的荧光点,与DAPI染色共定位。标记过氧化物酶体的菌株中,菌丝和孢子中可见小点状绿色或红色荧光,在脂类物质诱导下荧光点数量明显增加,符合过氧化物酶体分布及动态特征。细胞壁染色结果显示,细胞壁染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光互不干扰,标记效果良好。【结论】获得了理想的过氧化物酶体或细胞核荧...     

利用FLP/frt重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株

在植物转基因植株产生过程中,对转化细胞进行抗性筛选是通用程序,转化细胞的抗性一般是抗生素抗性或除草剂抗性,将赋予转化细胞抗性的选择标记基因删除是提高转基因植物生物安全性的重要措施。来自于啤酒酵母的FLP/frt位点特异性重组系统可有效删除同向定点重组位点frt之间的基因。通过多步骤重组,建立了可在植物中广泛应用的FLP/frt位点特异性重组系统。该系统包括含有frt位点的植物表达载体pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有由热诱导启动子hsp启动的FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA1300-hsp-FLP-hpt。利用二次转化的方式将二者先后转入烟草植株,热激处理后,热诱导型启动子hsp调控的重组酶FLP基因的表达催化位于选择标记基因als两侧同向frt位点间的重组反应,有效地删除了选择标记基因als。41%的经热激处理的二次转化植株发生了选择标记基因的删除,表明该系统在获得无选择标记基因的转基因植株中有很好的应用价值。     

昆虫遗传转化品系的常用标记

遗传转化标记是将遗传修饰昆虫从野生型种群中分辨出来的根据,遗传转化昆虫的鉴定、转化品系的维持及其遗传稳定性的监测都依赖于可靠的标记系统,发展易于应用和监测的转化标记能够极大地促进害虫遗传防治的相关研究。用于遗传修饰昆虫的转化标记主要有昆虫眼睛颜色标记基因、抗药性标记基因和荧光蛋白标记基因等。非果蝇类昆虫首个遗传转化品系的鉴定是通过眼睛颜色突变而实现,但大多数昆虫物种没有可用的突变体或缺少相应基因的信息,从而限制了眼睛颜色标记的应用。抗药性基因标记虽然能够通过对转化昆虫进行集体选择而大幅度提高筛选转化体的效率,但由于其鉴定的准确性不高且存在安全性问题,未得到广泛应用。荧光蛋白标记基因的发展则显著拓宽了能够转化的昆虫种类。从水母分离的绿色荧光蛋白(GFP)经突变方法获得了多种不同荧光性质的突变体,经人为修饰后与适宜的强启动子构成转化标记载体,能够有效鉴定更多昆虫物种的遗传转化个体,其中应用较多的是增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。此外,从珊瑚属海葵中分离得到的红色DsRed标记基因提供了多样化的红色荧光蛋白选择,在某些生物中DsRed与GFP联合应用的表现明显优于GFP突变体,所以其应用前景也非常广泛。本文着重从眼睛颜色、抗药性和荧光蛋白等3个方面阐述了标记基因的发展历史与现状,并对其今后的发展方向进行了展望。     

无标记（Marker—Free）：转基因植物研究的新趋势

目前 ,几乎所有的植物遗传转化中都要使用选择性标记基因诸如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子。为了消除由此而引起的公众的安全性顾虑 ,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。无选择标记的转基因植物具有许多独特的优势 ,如消除大众对转基因植物中含有选择标记基因而引起的恐惧及可以反复地向已转化的植物中叠加外源基因等 ,因此 ,这种新策略 (无标记 )有着巨大的应用潜力。本文对获得无标记转基因植物的一些途径做一综述。     

培育无选择标记的转基因植物

目前,几乎所有的植物遗传转化都要通过使用选择标记基因,如抗生素或除草剂抗性基因等来筛选转化子,虽然没有研究结果表明选择标记基因影响人类健康或环境安全,但近年来也引发了人们对转基因产品安全性的担心。为了消除公众对转基因食品的安全性顾虑,无选择标记的转基因植物应运而生。本文综述了共转化系统、位点特异性重组系统(包括FLP/FRT、Cre/lox、R/RS及Gin/gix系统)和转座子系统(Ac/Ds转座子系统)在培育无选择标记转基因植物中的应用。     

绿色荧光蛋白基因研究进展

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）基因是目前唯一在细胞内稳定表达,不需要任何反应底物及其它辅助因子,无种属,组织和位置特异性,其产物ＧＦＰ对细胞无毒性,且检测简单,结果真实可靠的新型报告基因,其特有的生物化学性质使其在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。     

盐爪爪Na^＋/H^＋逆向转运蛋白和焦磷酸酶的亚细胞定位

将盐爪爪Na+/H+逆向转运蛋白基因(KfNHX1)和焦磷酸酶基因(KfVP1)分别构建至植物表达载体,利用基因枪介导的方法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察研究其亚细胞定位.结果表明,转化了KfNHX1(或KfVP1)-GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞仅膜系统散发荧光,而对照组即未转入KfNHX1(或KfVP1)基因的细胞则整体均匀发出荧光.说明KfNHX1和KfVP1可能定位于细胞的膜系统,作为跨膜转运蛋白在离子的调控运输中发挥重要作用.     

植物遗传转化中选择标记基因的研究进展

标记基因在为植物遗传转化提供方便的同时也存在一些问题,综述了植物遗传转化中常用的选择标记基因、标记基因存在的问题以及解决选择标记基因安全性的策略.     

绿色荧光蛋白及其在GMOs 生态监测中的应用

绿色荧光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)是在海洋无脊椎动物水母(Aequorea victoria)中获得的一种由238个氨基酸组成的多肽。该多肽通过翻译后加工形成生色基团, 产生稳定的荧光, 而且这种荧光很容易被检测。GFP作为动、植物以及微生物基因工程研究上的一种广泛的选择标记, 具有检测灵敏度高、操作简便、不需要添加任何底物或辅助因子等优点, 更重要的是利用GFP可对GMOs进行快速、原位、实时、活体监测。本文概括介绍了GFP的特性、改造及其检测, 并从生态学角度论述了GFP在GMOs生态监测研究中的应用及其发展前景。     

绿色荧光蛋白及其在GMOs生态监测中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是在海洋无脊椎动物水母（Aequorea victoria）中获得的一种由238个氨基酸组成的多肽。该多肽通过翻译后加工形成生色基团,产生稳定的荧光,而且这种荧光很容易被检测。GFP作为动、植物以及微生物基因工程研究上的一种广泛的选择标记,具有检测灵敏度高、操作简便、不需要添加任何底物或辅助因子等优点,更重要的是利用GFP可对GMOs进行快速、原位、实时、活体监测。本文概括介绍了GFP的特性、改造及其检测,并从生态学角度论述了GFP在GMOs生态监测研究中的应用及其发展前景。     

转基因植物中筛选标记基因的利用及消除

在基因转移过程中,人们常常使用标记基因来筛选转化细胞或组织。常用的筛选标记基因尤其是抗生素抗性基因的使用往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且影响基因多重转化。为了消除这些弊端,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因植物应运而生。本文主要综述转基因植物中有关筛选标记基因及其消除方法。 Abstract:Selective marker gene is usually used to select transformed cells or tissue during gene transfer.However,the use of selective marker gene,especially antibiotic-resistant gene,is harmful to environment,plant development and affects multi-transformation.A new strategy that offers a approach for the elimination of those disadvantages caused by the selectable marker gene is developed.We summarized correlative marker genes used in transgenic plants and some methods of its removal.     

利用荧光蛋白标记西瓜枯萎病菌的过氧化物酶体及细胞核

西瓜枯萎病是一种世界范围的西瓜毁灭性病害,其病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)。研究病原菌生长发育和侵染的机制是解决病害的根本途径。利用荧光蛋白对细胞或细胞器进行标记,是病原菌研究中的重要方法。该研究利用绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白对FON的细胞核和过氧化物酶体进行了荧光标记。通过农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,AtMT),该文将3种不同的荧光定位载体分别导入FON,获得了细胞核红色荧光标记的转化子(潮霉素抗性,含mCherry-H2B融合蛋白),以及过氧化物酶体绿色(潮霉素抗性,含GFP-PTS1融合蛋白)和红色(潮霉素抗性,含DsRED-PTS1融合蛋白)荧光标记的转化子各1种。在标记细胞核的菌株中,菌丝、孢子都可见明亮、圆形的红色荧光点,荧光点与DAPI染色标记的细胞核区域完全重合。在过氧化物酶体标记的菌株中,菌丝、孢子中可见明亮的红色或绿色荧光成小点状分布,符合过氧化物酶体的分布特征,而且在脂类物质诱导的条件下,荧光点的数量明显增加。此外,该文还利用细胞壁荧光染色剂卡氏白对3种荧光蛋白标记菌株进行染色。结果显示,卡氏白染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光在FON中互不干扰。转化子继代培养和初步分析表明,其表型与野生型无差异,菌株继代后荧光表达稳定、定位明显。该结果为进一步研究FON细胞器动态、生长发育与致病分子机制提供了方法和工具。