IL-1β的基因克隆及在原核中的表达

从人外周血中分离出白细胞,提取其总RNA,根据文献报道的IL1β的核苷酸序列合成5′和3′端引物,用RTPCR的方法获得了IL1β的基因cDNA,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占全菌的40%,并对表达产物进行了分离纯化和活性分析,获得了纯度大于98%的样品,该样品表现出明显的生物学活性。     

白介素-1 β通过JNK/p38信号-转导通路调控肾系膜细胞表达α-平滑肌肌动蛋白

为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶（MAPK）家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素－1β（IL－1β）对大鼠肾系膜细胞（rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α－SMA）表达及其分布中的调控作用,以IL－1β（10ng/ml)刺激体外培养的rMC,用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL－1β对α－SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用,并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL－1β刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路,观察阻断对IL－1β刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示,IL－1β刺激6h可明显上调α－SMA启动子活性,在1－2d内显著促进其蛋白合成;IL－1β刺激24h后,细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL－1β诱导的α-SMA表达无明显影响;阻断JNK及p38通路均可使IL－1β诱导的α－SMA表达明显受抑;阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强,而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示,IL－1β可刺激rMC发生表型转化,其表型标志物α－SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达,在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL－1β刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径,而ERK通路不影响IL－1β的这一作用。     

趋化细胞因子及其受体——结构与功能的进展

趋化细胞因子（chemokine）之分子一级结构、cDNA克隆及其基因结构研究确立了其在功能上具选择特异性的α和β亚家族。LPS、IL－1、TNF、IL－4和INF等对其基因的表达起调节作用。α亚家族的代表IL－8基因5’－旁侧区中－94和－71碱基对之间的核苷酸元件为其基因转录激活所必需。IL－8分子N－端的ELR基序为其受体识别所必备。编码IL－8RA和RB、MIP－1αR、MCP－1RA和RB之cDNA已分离获得。G－CSF和LPS可调节IL－8受体基因的表达。     

白介素-1β对壁细胞酸分泌等胃功能的主要作用及机制

白介素（IL）－1β是已知具有胃细胞保护性,抗溃疡,抗分泌和延迟胃排空的最强力因子,它通过刺激胃内前列腺素合成而产生作用。IL－1β通过多种通路抑制培养壁细胞的酸分泌,该抑制发生于后受体水平。IL－1β对分泌酸的壁细胞,和分泌组胺的ECL细胞二者具有阻滞作用。壁细胞表达IL－1受体。IL－1β抑制卡马可和胃泌素刺激的壁细胞酸分泌作用,对组胺刺激也有一定作用。HP感染导致浸润的胃粘膜炎症细胞释放包括IL－1β的细胞因子。IL－1β可通过其对ECL细胞分泌组胺活性的抑制,相应地介导酸分泌的抑制。     

Balb／c小鼠左右两侧大脑皮层IL—1β，IL—6含量的不对称性

为探讨左右侧大脑皮层白细胞介素1β（interdeukine-1β,IL-1β）和白细胞介素6（interleukine-6,IL-6)的含量状况及与左右侧大脑皮层免疫调控异质性的关系,。分别取正常及细胞菌脂多糖（lipopolysaccharuide,LPS)刺激2h后的Balb/c小鼠的左右侧大脑皮层,制备匀浆液,用ELISA法检测匀浆液中IL－1β,IL-6的含量,结果显示,正常小鼠大脑皮层IL－1β,IL-6含量均为右侧显著高于左侧;LPS刺激后,左侧大脑皮层IL－6含量明显升高,右侧大脑皮层IL－6含量显著高于左侧大脑皮层,而左右侧大脑皮层IL－1β含量无明显差异,该实验结果表明,Balb/c小鼠在正常生理状态下两大脑皮层IL－1β,IL－6含量存在不对称性,左右侧大脑皮层免疫调控异质性可能与细胞因子的不对称性有关。     

超广谱β-内酰胺酶SHV-18的表达纯化及活性验证

目的：产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制,该类酶主要水解青霉素类、头孢菌素类以及单环酰胺类抗生素。自从1983年第-次有关p内酰胺酶的报道开始,至今已经发现超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的种类超过400种,其中SHV型是最常见的ESBLs类型之一。本研究主要探讨了超广谱β-内酰胺酶SHV－18的原核表达载体的构建、酶的纯化和活性验证。方法：利用肺炎克雷伯菌ATCC700603全基因组为模板,应用分子生物学技术钓取SHV-18基因,构建pET22b（＋）-SHV－18表达质粒,经测序鉴定后,转化大肠杆菌Transetta（DE3）,IPTG诱导表达并亲和纯化,进-步通过抗生素水解实验,检测其水解活性,测定其酶动力学参数。结果：成功构建了可以以裂解上清形式高效表达SHV-18的工程菌。通过亲和纯化最终获得纯度达到90％以上的β-内酰胺酶SI-IV-18。获得的SHV-18蛋白能够水解青霉素G、头孢拉定、头孢唑肟、头孢他啶、头孢吡肟等多个抗生素。结论：获得了对青霉素和头孢菌素类具有水解活性的超广谱β-内酰胺酶SHV-18,并对其酶动力学参数进行了检测。在实验室研究了β－内酰胺酶SHV－18对不同抗生素的水解特性,更加有利与指导临床抗生素的合理使用。     

孤啡肽对海马IL—1β表达的调节作用

采用原位杂交,免疫荧光双标技术及大鼠创伤应激模型,观察孤啡肽对海马白介素－1β（IL－1β）表达水平的影响,结果显示,侧脑室注射抗大鼠IL－1β抗体能明显改善创伤介导的免疫反应,即有效下调巨噬细胞分泌IL－1和TNF－α的能力,侧脑室注射孤啡肽后2h海马IL－1β的表达明显下降,且此作用能反啡肽受体拮抗剂阻断,免疫荧光双标结合激光共聚焦显微镜观察发现,孤喱肽的受体在神经经元,星形胶质细胞及小胶质细胞均有表达,实验结果提示,海马的IL－1β参与创伤应激介导的免疫反应,孤喱肽的神经免疫调节作用可能是通过作用于海马的中枢神经细胞,抑制L－1β的合成及释放而完成的。     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子ＧＡＬ１的穿梭表达质粒ｐＹＥＳ２中,并把得以的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失９０％以上的ｐｅｐ４－３突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β－半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β－半乳糖苷酶少水平不仅均要高于另一对照菌株,并且ｐｅｐ４－３突变菌株表现受葡萄糖阻遏的严紧程     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYESZ中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4－3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β-半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β-卜半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4－3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β-半乳糖苷酶在pep4－3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

人IL-18的基因克隆、表达及纯化

目的 :克隆人IL 1 8基因 ,并构建高表达人IL 1 8的工程菌 ,纯化获得重组人IL 1 8。方法 :从人肿瘤组织内提取总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应扩增人IL 1 8基因 ,在基因的 5′和 3′端分别加上NcoI和EcoRI酶切位点 ,酶切后直接克隆至质粒表达载体pET2 8a( + )内 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,挑选转化子 ,IPTG诱导后SDS PAGE筛选高表达人IL 1 8的工程菌。提取表达菌质粒进行DNA序列分析。表达菌大量培养及IPTG诱导后 ,超声破菌收集包涵体 ,十二烷基肌苷酸钠溶解后用阳离子柱和分子筛纯化。结果 :克隆的人IL 1 8基因序列完全正确 ,工程菌表达的人IL 1 8约占菌体蛋白 30 % ,以包涵体形式存在 ,经阳离子柱和分子筛纯化获得了较纯的人IL 1 8。结论 :可用构建的工程菌大量制备人IL 1 8,为开展人IL 1 8药物的临床前研究奠定了基础。     

妊娠大鼠子宫和胎盘IL-1 β表达及IFN-γ对其表达的影响

为探讨妊娠过程中白介素 1β (IL 1β)表达的变化及干扰素 γ (IFN γ)对其表达的影响 ,以妊娠Spre qne Dawley大鼠为模型 ,采用逆转录 -聚合酶链反应的方法检测了妊娠不同时期子宫和胎盘IL 1βmRNA表达的动态变化及IFN γ对子宫和胎盘IL 1βmRNA表达的影响。实验结果表明 ,在胚泡植入子宫内膜前 ,子宫组织内IL 1βmRNA的表达较高 ,胚泡刚植入时 ,IL 1βmRNA的表达显著降低 ,之后 ,随着胚胎的发育和胎盘的增生 ,子宫组织内IL 1βmRNA的表达逐渐升高。妊娠早、中、晚期胎盘IL 1βmRNA没有显著性差异。注射超生理剂量的IFN γ后 ,植入前期、植入后期及妊娠中期和妊娠晚期IL 1βmRNA的表达均显著减少 ,胎盘IL 1βmRNA的表达在妊娠晚期出现下降。上述结果提示 ,高剂量的IFN γ对妊娠一定时期的大鼠子宫和胎盘IL 1βmRNA的表达有抑制作用     

三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素的研究

利用三孢布拉氏霉发酵生产天然β－胡萝卜素。在30L发酵罐中,平均生物量31．3g干菌重／L发酵液和胡萝卜素1213．1mp／L;在3M³发酵罐中,平均生物量38.0g干菌重／L发酵液和胡萝卜素1146．5mg／L。将中试样品经HPLC分析,在总色素中β-胡萝卜素占92～96％,其他类胡萝卜素占8～4％;在β-胡萝卜素中,反式异构体占90～95％,9－、13－、15－顺式异构体占10～5％。结晶β－胡萝卜素呈多种形状,但大多数为两端锥形的棱柱体。在胡萝卜素提取中,工艺和技     

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表 …

通过ＰＣＲ方法从羊肝总ＤＮＡ中获得了羊－β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因第一和第二内含子,以羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５’区５ｋｂ为调控序列,构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测,获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠,整合率为３２％。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,在一些转基因鼠乳     

白细胞介素13

IL－13是新近发现的一种新的细胞因子,由Th2细胞产生,人IL－13（hIL-13)的分子量为17kd(糖量化）和12．4kD( 非糖基化）;鼠IL－13（mIL-13)的分子量为14kD;二者的氨基酸序列同源性为58％,hIL-13和mIL-13的基因定位于人第5号染色体和鼠第11号染色体上,并与IL－4基因紧密连锁,二者的cDNA同源性为66％,重组IL－13（γIL－13）具有多种生物学活性刺激前髓样细胞增殖,诱导单核细胞表达MHC II类抗原和CD23,促进B细胞增殖,分化和分泌Ig,抑制炎症因子的产生和HIV－1的复制,抗肿瘤等,对其深入研究将有助于认识IL－13在炎症反应的发生和发展以及调节免疫应答方面的作用,并为其临床应用的可能性提供理论依据。     

白细胞介素—2及其受体与肿瘤基因治疗

作为最重要的细胞因子之一,白细胞介素－2（IL－2）抗瘤作用的研究一直引导着肿瘤生物免疫治疗的方向,本从分子生物学的和细胞生物学角度介绍IL－2的结构,激活信号系统,功能活性,各免疫细胞的IL－2分泌动力学特点,IL－2受体亚单位组成,表达调控,功能意义及在不同细胞中的表达状况,IL－2基因转导接种疗法的基本方法,作用原理,主要优点,近年获得的实验与临床研究数据,以及待解决的问题等。     

人尿激酶原（pro－urokinase）基因在大肠杆菌中的高效表达

本文用ＰＣＲ方法对人工合成的尿激酶原。ＤＮＡ基因５’端进行改造,将之克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,转化大肠杆菌ＪＡ２２１,经ＩＰＴＧ诱导,获得了占总菌体蛋白１５％的高表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在。经体外交复性,从１升培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

IL—5在非复制重组痘苗病毒中的表达及其对重组病毒免疫效效果的影响

利用非复制痘苗病毒表达载体pNEOCKβ751IL5和重组病毒RVJ123,通过两步重组构建了能同时表达IL－5和乙型肝炎病毒HBsAg的非复制型重组痘苗病毒RVJ123△11β75IL5。Southern-blot证实,痘苗病毒C－K片段间基因缺失的同时伴有IL－5基因的插入,鼻腔吸入分别免疫Balb/c小鼠和新西兰白兔。ELISPOT实验证实,免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgA抗分分泌细胞（ASC）数比对照组（RVJ123△11β75）增加约2倍,而同时小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgG抗体分泌细胞（ASC）数与对照组无差别。可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其它分泌液样品中检测到抗乙型肝炎病毒HBsAg的特异性的IgA,IgG抗体,与对照组相比,IgA抗体阳性转率及抗体滴度提高,而IgG则无差异。本实验说明：IL－5可在体内选择性地增强机体的粘膜IgA反应。提示非复制载体疫苗中,表达的该细胞因子有效的增强疫苗的的粘膜免疫反应,为粘膜疫苗的发展策略提供了新的途径。     

细胞因子基因导入人肿瘤细胞的方法及鉴定

从人外周血单核细胞中抽提总RNA为模板,分别用5’含EcoRⅠ、3’含BamHⅠ限制性酶切位点的细胞因子基因特异引物合成合信号肽全长IL－2、γ－IFN及α－TNFcDNA．然后将这些细胞因子cDNA分别重组入含筛选标记基因Neo的逆转录病毒载体LXSN中．采用磷酸钙共沉淀法转染逆转录病毒包装细胞系PA317．分别收集到含IFN－γ、TNF－α和IL－2基因的缺陷型逆转录病毒上清及只具空白载体质粒pLXSN的病毒上清这四种病毒颗粒用于导入人肝癌、胃癌细胞,可获得单克隆化的细胞因子基因修饰株PCR,Southern,RT－PCR及Northern杂交证明,有相应细胞因子及筛选标记基因的转入和表达生物活性分析也证实各基因修饰株细胞培养上清液中有一定活性的相应细胞因子．结果表明逆转录病毒介导的细胞因子基因转移是成功的     

外源NF—IL6高表达增强巨噬细胞的细胞毒效应

白介素6核转录因子（NF－IL6）的功能非常广泛,它不仅参与炎症反应和急性期蛋白质基因、细胞因子基因的表达调控,还参与肿瘤的凋亡、抑制和维持巨噬细胞的免疫功能。为探讨NF－IL6基因的表达与巨噬细胞肿瘤杀伤活性的关系,我们用含重组NF－IL6基因编码区的表达质粒pCN,转染小鼠腹腔留居巨噬细胞,并用蛋白质印迹法证实了外源NF－IL6基因在巨噬细胞中的高表达;随后用碱性磷酸酯酶法检测高表达NF－IL6基因的巨噬细胞对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒性。结果显示,外源NF－IL6基因的过量表达明显增强小鼠腹腔巨噬细胞对该肝癌细胞的细胞毒活性。这表明人工加强NF－IL6的表达能增强巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。     

山羊胎儿肝脏3β—羟基甾体脱氢酶／Δ^4—Δ^5异构酶（3β—HSD）cDNA的克隆

3β－羟基甾体脱氢酶／Δ^4-Δ^5异构酶（3β－HSD）是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶,且具有异构酶活性。3β－HSD催化3β－羟基甾体的脱氢及随后的Δ^5-3-甾酮产物的异构化反应,以产生α,β－非饱和酮,3β－HSD在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料,首次获得了山羊胎肝的3β－HSD的cDNA,并进行了3β－HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛,啮齿类的3β－HSD CDNA的高同源区设计引物,以2－3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板,经RT－PCR获得416 bp cDNA片段（Fig.a),然后以其为探针筛选胎羊肝λgt10cDNA文库最后获得3－端缺失的3β－HSD cDNA克隆,并推导了其氨基酸序列（Fig.s)。同源分析表明山羊胎肝3β－HSD的氨基酸序列与牛卵巢,人I型3β－HSD的同源性分别为96％,78％和73％（Fig.3),提取雌性胎羊,雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA,同时做RT－PCR,表明3β－HSD在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β－HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号（Fig.4)。